抑菌剂PPT课件.ppt

1、天然抑菌剂研究进展,沈群 62737524 shenqun,1,一、微生物源天然防腐剂 二、动物源天然防腐剂 三、植物源天然食品防腐剂,2,一、微生物源天然防腐剂,（一）细菌 1946年，Gratia对大肠杆菌V菌株抑制菌株现象进行研究时发现了类似于噬菌体，但不能够自主复制的物质，称为大肠菌素 。 已经发现几十种细菌素。,3,细菌素素(bacteriocin ) ： 是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成产生的一类具有抑菌生物活性的蛋白质或多肽，其抑菌范围不局限于同源菌，产生菌对其细菌素有自身免疫性。,4,命名：细菌素以生产菌而命名。 如大肠杆菌产生的细菌素称大肠菌素，绿脓杆菌产生的称绿脓菌素

2、。,细菌素的分类,5,分类：根据化学结构、稳定性和分子量大小可分为四类 。 第一类定义为羊毛硫抗生素(Lantibiotics) 是一类小分子的修饰肽，含1950个以上的氨基酸分子，分子活性部位有羊毛硫氨酸(Lanthionine). -甲基羊毛硫氨酸( -methyllanthionine)、脱氢酪氨酸(Dehydrobutyrine)和脱氢丙氨酸(Dehydroalanine)等氨基酸。,6,第二类是小分子的热稳定肽（SHSP) 分子量小于10KDa，具有疏水性和膜活性，其结构特征为：N末端信号肽序列长度为1821个氨基酸，前导肽链由一个蛋氨酸开始，并常随一个赖氨酸；有活性的细菌素其N-末

3、端+1的位置上通常是赖氨酸或精氨酸；,7,第三类是热敏感的大分子蛋白（LHLP) 分子量一般大于10KDa，通常在100或更低温度30s内即失活，它们的抑菌谱较窄。,8,第四类是复合型的大分子复合物，除蛋白质外还含有碳水化合物或类脂基团。这类细菌素还未被纯化。,9,第二、三、四类细菌素由于不含羊毛硫氨基酸，所以通常又被称为非羊毛硫抗生素(non-lantibiotic bacteriocin)，,10,11,细菌素与抗生素的区别,12,细菌素通常是通过核糖体来合成，是真正的蛋白质类物质。大部分细菌素只对近缘关系的细菌有损害作用，而且无毒、无副作用、无残留、无抗药性，同时也不污染环境。 抗生素是

4、通过酶促反应将初级代谢物转变为结构性的二级代谢物，诸如短杆菌肽S等，通过酶促反应把氨基酸转变为结构复杂的化合物。抗生素必须是化学合成的，其基因操纵的复杂性是由于涉及的基因数量增加所造成的。,13,细菌素的抑菌范围,细菌素通常由革兰氏阳性菌产生并可以抑制其它的革兰氏阳性菌，如乳球菌、葡萄杆菌、李斯特氏杆菌等，对大多数的革兰氏阴性菌、真菌等没有抑制作用。,14,细菌素的作用机制,Mersacidin是抑制肽聚糖前体的合成； Nisin主要是抑制细胞壁中肽聚糖的合成，从而使细胞壁和磷脂的合成受阻，使细胞质溢出。,15,1. 小菌素 主要由肠杆菌科细菌产生,16,2. 乳酸菌素 乳酸菌(包括乳球菌、片

5、球菌、乳杆菌和明串珠菌)所产细菌素，已经发现了几十种细菌素。 乳酸菌素分为两类： 线型阳离子肽：乳酸链球菌的Nisin乳链菌肽，乳球菌肽，尼生素)，以及枯草芽抱杆菌产生的枯草菌素(subtilin ) 等。线型乳酸菌素中Nisin性能最好。 小环形电中性肽：链霉菌属菌株产生的肉桂霉素、耐久霉素等。,17,2.1 乳链球菌肽（ Nisin ）,18,2.1.1 Nisin的发展史,1928年Rogers等人在美国首次报道乳酸链球菌的代谢产物能抑制乳酸杆菌的生长； 1933年Witehead等人进一步证明了这种抑制效果源于代谢产物中的一种多肽； 1947年Matlick等人分离制备了这种多肽，因乳

6、酸链球菌在分类上属血清学N群，所以以“Nisin”冠之，由Group N inhibitory substance而来(N群抑菌物质之意)；,19,1951年，Hirsch等首先将Nisin用作食品防腐剂，成功地抑制了肉毒棱状芽饱杆菌引起的埃门尔奶酪(Emmental Cheese)的膨胀腐败; 1953年由英国阿波林不莱特(Aplin Barrett )公司生产的第一批商业化Nisin在英国面市，其商品名称为Nisaplin。 1971年，Gross等人搞清楚了 Nisin的全部分子结构。,20,2.1.2 Nisin的理化性质,2.1.2.1 结构 Nisin是乳酸链球菌、嗜热乳酸链球菌、

7、乳脂链球菌、酿脓链球菌等分泌的一种多肽类抗生素。 由34个氨基酸残基组成，分子量为3510道尔顿。 活性分子常以二聚体或四聚体的形式出现，分子量分别为7000和14000道尔顿。,21,22,如上图，多肽氨基(NH2-)端为异亮氨酸， 羧基(-COOH)端为赖氨酸。 含有5种异常氨基酸： 脱氢丙氨酸(Dha)； -甲基脱氢丙氨酸(Dhb)； 氨基丁酸(Aba)； 羊毛硫氨酸(Ala-s-Ala )； -甲基羊毛硫氨酸(Ala-s-Aba )； 且有5个硫醚键形成的分子内环。,23,2.1.2.2 溶解度 Nisin的溶解度依赖于溶剂的pH值 pH值为2.5时溶解度为12； pH值为5.0时降低

8、到4%,； pH值在7.0以上时几乎不溶解。,适用于低pH值食品 Nisin最好的溶剂为0.02mol/L的盐酸溶液 使用时应先用0.02mo1/L盐酸溶解后再加到食品中,24,25,21.2.3热稳定性 Nisin的热稳定性与环境的pH值有关。 在pH值为2.0或更低的酸性环境中，Nisin可经115.61加热而不失活； 而在pH值为5.0时，加热后抑菌效果降低40； pH值为6.8时降低90%。,26,27,引起Nisin失活的主要原因是高温和低酸条件。 在食品体系中，由于受牛奶、肉汤等大分子的保护，Nisin的稳定性大大提高。,28,2.1.3 Nisin的抑菌机理,2.1.3.1抑菌范

9、围 Nisin对许多革兰氏阳性菌(G+)，尤其是能产芽孢的G+菌具有很强的抑制作用。 乳制品中的金黄色葡萄球菌、肉毒杆菌等; 啤酒中的乳杆菌、明串珠菌等; 罐头中的嗜热脂肪芽孢杆菌、致黑羧菌等； 李斯特菌。,29,一般400IU/ml (10mg/kg)的Nisin足以杀死绝大多数G+菌。 Nisin一般不能杀死细菌孢子，而孢子在萌发膨胀时，会对Nisin敏感而被杀死。,30,31,32,21.3.2抑菌机理 目前对Nisin的抑菌机理尚不完全清楚。 机理1： Nisin的作用机理类似于阳离子表面活性剂，其作用位点是细节膜。 Nisin首先被菌体吸收，进而引起原生质膜去极化，细胞内K+迅速流失

10、、细胞呼吸受阻、ATP泄漏，膜内外质子动力势(pmf )消失。 流出胞外的ATP占胞内ATP降低量的20，这说明Nisin还能引起胞内ATP的降解(如水解) 。,33,机理2： Winkowsk （1994)等人认为Nisin是以在细胞膜上形成穿孔而不是以表面活性剂的形式作用,34,机理3： 而Cutter等人Nisin处理后细胞内容物发生外漏,35,2.1.4 安全性,天然存在于人们日常食用的牛奶中。 是一种多肽物质，食用后在消化道中很快被a-胰凝蛋白酶消化成氨基酸。,36,2.1.5 Nisin的应用,1乳制品中的应用 Nisin在酸奶中的应用有很多生产企业都在进行。,37,38,2罐头制

11、品中的应用,39,3.其它,肉制品：Nisin可以部分地替代亚硝酸盐，并有效防止肉毒羧状芽孢杆菌毒素的形成； 饮料：Nisin可以与酵母一起生产啤酒、果酒、乙醇饮料以及工业酒精，防止杂菌污染 ； Nisin还可以用于奶油、巧克力、有机酸、多糖、氨基酸和维生素发酵工业中，减少G+菌的污染。,40,（二）酵母菌和某些丝状真菌,自然界有一类嗜杀酵母(killer yeast)，在其生长繁殖过程中能向体外分泌一种毒蛋白嗜杀毒素，杀死同族及亲缘酵母。 酿酒酵母的K1毒素，该毒素有 和 两个亚基，二者中间被糖基化 肽隔开。 其杀菌作用机制的主要原因是造成细胞质膜的离子泄漏。 酵母属(裂殖酵母属、假丝酵母属

12、)中的某些菌株，通过富集培养，能够产生一种蛋白质，对某些细菌具有明显抑制作用。,41,（三）食(药)用菌,竹荪菌丝对革兰氏阳性细菌(乳酸菌、枯草杆菌)，革兰氏阴性菌(醋酸菌、谷氨酸菌等)，甚至对酵母菌、霉菌都有明显的拮抗作用。 灵芝对大多数细菌和霉菌有一定抑菌作用。,42,侧耳属中分离到的侧耳素，具有广谱抗菌性，对革兰氏阳性、阴性菌、分枝杆菌、噬菌体等均有较高的抗菌活性。 密环菌中的蜜环菌素甲素和蜜环菌素乙素，水曲素以及马勃素等都具有抗菌、抗病毒作用。,43,（四）霉菌和放线菌,巨曲霉中的一种小分子量的碱性蛋白质，对丝状真菌的生长具有抑制作用。 红曲霉素发酵液也具有抑菌作用。 米曲霉发酵所产生

13、的曲酸对某些细菌和真菌具有抑制作用。,44,纳塔尔链霉菌产生的纳他霉素(Natamycin )匹马菌素(Pimaricin )，它是一种多烯烃大环内酯化合物，能有效地抑制和杀死霉菌、酵母、丝状真菌，但其对细菌和病毒无效。它也是被许多国家批准使用的微生物天然防腐剂。,45,46,链霉菌SO1产生的几丁质酶对真菌的抑制具有一定的广谱性、其抑制机理在于破坏真菌的细胞壁(分解细胞壁中几丁质)，从而导致细胞内容物外溢，而造成菌丝不能生长。,47,二、动物源天然防腐剂,48,1鱼精蛋白(protemine),49,一种小而简单的蛋白质，存在于鱼的精子细胞中，通常从鲤、蜻、鳍等成熟雄性鱼白制备而得。 鱼精蛋

14、白是一种白色至淡黄色粉末，有特殊味道，热稳定性较好。,50,属强碱性蛋白质，故其抑菌作用偏向于弱碱性条件(pH79时最强)。在碱性介质中的最小抑菌浓度为70400mg/mL。 对耐热芽孢菌、乳酸菌、金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性菌和霉菌、枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、胚芽乳杆菌、干酪乳杆菌等均有抑菌作用。,51,52,对热稳定(120 , 30分钟)，在210 , 90分钟仍具抑菌能力，故宜于加热配合。 与甘氨酸、醋酸钠、酿造醋等合用也有增效作用。,53,在牛奶、鸡蛋、布丁中添加0.05% 0.1%鱼精蛋白。 延长鱼糕制品的有效保存期也有作用。 与甘氨酸等配合使用，抗菌效果更

15、好，食品防腐范围也更广。 主要用于肉类、鱼糜、冷冻面团、米饭等中性并需加热杀菌的物质。,54,55,2.壳聚糖(chitoson ),脱乙酰甲壳质，是甲壳质(chitin)的一种衍生物。从蟹壳、虾壳中提取的一种天然多糖。 浓度为0.4%时，对大肠杆菌、荧光假单孢菌、普通变形杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌等均有抗菌性，可作为一种价廉、高效的天然肉品防腐保鲜剂。 壳聚糖不溶于水。,56,0.1%或1%的壳聚糖醋酸溶液可完全抑制金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌和热带假丝酵母的生长。,57,氨基葡萄糖盐酸盐(Glucosamine Hydrochloride，简称GAH) GAH是壳聚糖的衍生物，可用海洋

16、甲壳动物的外壳制得，是一种海洋生物制剂。 对正常机体无有害影响，可作为防癌、抗癌的食品添加剂，能刺激婴儿肠道中双歧杆菌的增长，参与肝、肾解毒，对人体具有重要的生理效应。,58,59,60,3.贝壳提取物,贝壳提取物对根霉、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌等有很好的抑制效果，其最小抑菌浓度分别为0.0215%，0.043%，0. 043%。 假单孢菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、大肠杆菌和毛霉也有较好的抑制作用，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、肠链球菌也有一定的抑制作用。,61,4蜂胶(propolis ),蜂胶是蜜蜂从植物幼芽及树干上采集的树脂，混入鹦的分泌物、蜂蜡等加工而成的一种具有芳香气味的不透明胶

17、状固体。 呈黄褐色或灰褐色，味微苦，不溶于水，溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，成分复杂。,62,蜂胶对肠道致病菌和条件致病菌均有较强的抑菌能力，尤其对沙门氏菌和福氏痢疾杆菌的抑菌力更强。,63,5抗菌肽类,5.1柞蚕抗菌肽(cecropins) 瑞典科学家Boman首先从惜古比天蚕(Hyalo -phora cecropia)蛹诱导分离得到。 目前已从鳞翅目和双翅目昆虫中分离出20多种cecropin类似物，甚至在猪肠中也发现了类似杀菌肽。 它们可有效杀死革兰氏阳性和阴性菌，但对真核细胞无作用。但对某些革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌无活性作用。,64,作用机制是通过在细菌胞膜上形成电势依赖

18、通道(voltage dependent channel)，改变细胞膜的通透性，使细胞内容物泄漏而杀菌。 它含有35-37个氨基酸残基、分子量为4Kda的阳离子型多肽。N端和C端都有a-螺旋结构，通常呈碱性，带正电荷、亲水；C端酞胺化，中性或微酸性，不带电或带少量负电荷，疏水。 从家蚕体中分离到一种新型抗菌肽Moricin 。它对革兰氏阳性菌具有较强的抗菌活性。,65,5.2防卫肽(defensins ) 与柞蚕抗菌肽相似，这类抗细菌肽在分子中也形成两性分子的a螺旋结构，但在这肽分子中含有半胱氨酸，并形成分子内二硫桥。,66,昆虫体中与哺乳动物防御素高度同源的类似防卫肽称为昆虫防御素(inse

19、ct defensins)。 它首次从肉蝇(Phormia terranovae )中分离得到，后来在麻蝇体中也发现了这类抗菌肽，而被命名为sapecinso Defensins是在昆虫中诱导产生的最广泛存在的抗菌肽，在双翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目昆虫中都有发现。 它们仅对革兰氏阳性菌有抗菌活性，对革兰氏阴性菌或真核细胞无作用。它可以抑制细胞膜上的Ca+通道，激活K+通道。,67,5.3富含甘氨酸(attacin-like)的抗细菌多肽类 其中一种就是attacins，分子量大于20Kda。从惜古比天蚕中分离出6种attacin，其中4种呈碱性，2种呈中性或微酸性。 碱性和酸性attacin

20、同源性高达80% , attacins仅对部分革兰氏阴性菌表现抑菌作用。,68,5.4富含脯氨酸的抗细菌多肽类 蜜蜂血淋巴中存在4种富含脯氨酸的抗细菌肽类。其中3种均由18个氨基酸残基组成，称为Apidaecins，而另一种抗菌肽abaecin，含有34个氨基酸残基，与apidaecins没有明显的同源性。但这些分子均富含脯氨酸，且都只对革兰氏阴性菌有作用。,69,5.5爪蟾抗菌肽(magainin) 存在于蛙的皮肤和胃中，它的抗菌谱较广，包括革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌。 一般由21一25个氨基酸残基组成，碱性氨基酸含量高，结构中有一个双亲的。-螺旋结构，并在N端都有谷氨酸。,70,三、植物源

21、天然食品防腐剂,71,1香辛料提取物,有强烈抗菌作用的香辛料有:肉桂、丁香、牛至、肉豆寇、大蒜，山箭菜等。 许多香辛料的乙醇提取液对革兰氏阴性茵和阳性菌有抑制作用。认为其辛辣组分是抗菌有效成分。,72,2.植物芳香精油,牛至，丁香属，易挥发精油的两种成分百里香酚和香芹酚，它们是精油的主要成分。 在植物生长中期提取的精油对黑曲霉、类孢镰刀霉菌，青霉菌有强抑制作用。蔗糖发酵液中对酵母的最低抑菌浓度(MIC)是1.0 uL/mL,该精油可用于食品添加剂领域的抑真菌剂。 山苍子，其精油有明显的抗真菌作用，如对尖孢镰刀霉菌、长蠕孢霉、葡柄霉有抑制作用。,73,3果酸分解产物,果酸存在于苹果、葡萄、柑橘等水果和蔬菜中，除了含有半乳糖醛酸以外，还含有半乳糖，阿拉伯糖，鼠李糖等中性糖。 未分解的果胶和半乳糖醛酸完全没有抗菌作用，而果胶的酶分解产物才有抗菌作用。 植物糖有抗真菌活性。在pH6以上抗菌性能明显下降,74,4琼脂低聚糖,琼脂是从海藻中提取的，主要成分是琼脂糖和琼脂果胶，琼脂糖在琼脂酶的作用下形成新琼脂低聚糖(主要是四糖和六糖)，其水溶液是无色无臭糖液，但甜味不强。