FISH技术在血液肿瘤中的应用

1、FISH技术在血液肿瘤中的应用,FISH-目前新兴的分子遗传学技术，原理是采用荧光标记的DNA探针，利用探针与检测样本中DNA碱基对的互补性，在探针与标本的DNA杂交后，通过荧光显微镜检测荧光信号而得出结果，从而检测细胞、组织样本中的染色体和基因异常。,荧光原位杂交 Fluorescence In Situ Hybridization, FISH,FISH基本实验过程,FISH探针种类,根据标记颜色的不同，常用探针主要有： 单色探针（single color probe, SC） 双色探针（dual color probe, DC） 三色探针（triple color probe, TC） 双

2、色分离探针（ dual color, break apart probe, DC, BCR） 双色单融合探针（ dual color, single fusion probe, DC, SF Trans） 额外信号探针（extra signal, ES） 双色双融合探针（ dual color, dual fusion probe, DC, DF Trans）,单色探针（SC）： 双色探针（DC）： 三色探针（ TC）：,D7S486,CEP7,CEP18,Y,X,正常,正常,正常,异常,异常,异常,FISH技术的应用,FISH检测在临床上主要应用于： 血液系统疾病：白血病、MDS、MM等；

3、实体瘤：乳腺癌、膀胱癌等； 产前遗传筛查：唐氏综合症（21三体）等 临床意义： 从遗传学角度检测染色体和基因的异常 辅助诊断，判断预后，疗效检测及微小残留检测,FISH技术在血液肿瘤中的应用,血液系统肿瘤是我国十大高发肿瘤之一。大量研究表明，不同类型的血液肿瘤往往有其特异的染色体异常，对肿瘤分型、诊断、治疗和预测用预后都具有重要意义。常规细胞遗传学分析（CC）方法只能分析中期染色体，而对间期细胞、复杂核型细胞和染色体微缺失无法进行诊断。FISH技术弥补了CC在这方面的不足，因此被广泛应用于血液肿瘤的研究、诊断等方面。,白血病的细胞遗传学异常,血液肿瘤的FISH检测,临床上对血液肿瘤的FISH检

4、测主要集中在以下几个方面： 染色体易位形成的融合基因检测：如CML的BCR-ABL、M3的PML-RARA、M2b的AML1-ETO融合基因等； 基因缺失检测：如CLL的P53基因缺失提示患者预后很差，而13q单一缺失则提示预后较好； 对异性间造血干细胞移植的植入状态检测：通过性染色体计数探针动态监测供/受者混合性嵌合体比例变化对异性间异基因造血干细胞移植后植入状态进行监测； 微小残留病灶（MRD）的检测：通过对肿瘤细胞特异的染色体异常进行跟踪监测，预测疾病进展和有无复发迹象。,血液肿瘤荧光原位杂交探针,多发性骨髓瘤（MM）检测,MM常涉及多种染色体异常，主要为数目异常，分为超二倍体（+3、+

5、5、+7、+9等）和非超二倍体（-8、-13、-14、-17等）；染色体结构异常较少见，主要有1号（1p、1q，部分缺失或1q三体）、13q-、14q（多为与14q32有关的几种互补易位）等。 MM FISH检测位点：P53、RB1、D13S319、IGH基因及1q21位点。 推荐样本：骨髓 适用人群：已确诊为MM，需评估预后、进行个体化治疗的患者,以p53探针模式图为例，17号染色体1区3带1亚带包含p53的区域标记了一段含绿色荧光的260kb DNA序列；D13S319指13号染色体上独一无二的编号319的DNA片段，标记了一段含红色荧光的220kb DNA序列。正常情况下显示2R2G信号

6、，发生D13S319位点缺失时显示1R2G。 IGH的探针在基因的两端分别标记了红色和绿色荧光，正常情况下显示红色绿色重叠信号或黄色信号，当IGH发生易位时显示为红色和绿色的分离荧光信号。,临床意义,判断生存期 预后较差：P53缺失（24.7个月） 1q21 扩增（21.9个月） IGH发生t(4;14)，t(14;16)易位（24.7个月） 预后中等（42.3个月）：RB1缺失 D13S319缺失 预后较好（50.5个月）：IGH发生t(11；14)易位或者其他遗传改变 指导临床用药（个体化治疗）：MM的初治治疗多选用化疗，包括MP方案（马法兰、泼尼松）、VAD方案（长春新碱、多柔比星、地塞

7、米松）等；对于难治和复发的多发性骨髓瘤，多采用联合化疗和沙利度胺进行治疗；干扰素主要用于维持治疗，对上述治疗方法无效者可进行造血干细胞移植。对于预后好的患者，使用干扰素、环磷酰胺或联合化疗没有明显的区别；对于预后中等的患者，使用干扰素治疗反而会缩短患者总生存期。可见，多发性骨髓瘤基因异常的检测对临床有效开展个性化治疗提供了重要依据。,白血病FISH检测,1、 慢性淋巴细胞白血病（CLL）检测 检测位点： P53、RB1、D13S25、ATM基因以及12号染色体。 推荐样本：外周血 临床意义： 判断生存期：预后差，P53缺失（32个月） 预后较差， ATM缺失（79个月） 预后中等， CSP 1

8、2三体（114个月） 预后较好，RB1缺失、 D13S25缺失（133个月） 指导临床用药（个体化治疗） 7-11%CLL伴有P53缺失，预后不良，漂吟类似物治疗无效，应选用不涉及p53信号传导系统的药物； ATM位于染色体11q22-23，11q22.3缺失是CLL另外一个预后较差的核型异常，发生率12-20%，ATM缺失与CLL进展密切相关； +12是最早发现的B-CLL常见染色体异常，发生率15-35%，常伴有其他核型异常； 13q缺失是CLL最常见的染色体异常，40-60%的CLL出现该异常。RB1和D13S25位于此位点，单纯del(13q14)预后较好，若伴有+12、11q-等其他

9、染色体异常，则预后通常较差。,2、 慢性粒细胞白血病（CML）检测 检测位点： BCR/ABL融合基因、ASS基因。 推荐样本：骨髓 适用人群：CML初诊及治疗监测的患者,慢性粒细胞性白血病是一种发生在早期多能造血干细胞上的恶性骨髓增生性疾病（获得性造血干细胞恶性克隆性疾病）。 对CML的检测主要针对BCR/ABL融合基因，这种融合基因是通过（9；22）号染色体的基因重排及易位而形成的。,BCR/ABL融合基因检测 BCR/ABL融合基因通过t(9;22)号染色体易位而形成。9号染色体上原癌基因(ABL)的断裂点比较恒定，22号上断裂点簇集区(BCR)的断裂点不恒定。 BCR-ABL-210见

10、于95的CML(主要断裂点断裂形成)，BCR-ABL-190见于17%-30%的成人急性淋巴细胞白血病和2%-6%的儿童急性淋巴细胞白血病(次要断裂点断裂形成)，但从染色体组型与慢性粒细胞白血病的费城染色体在形态上看不出区别，FISH检测BCR/ABL融合基因可以区分。 检测探针： 额外信号探针（ES ）：可区分BCR/ABL融合基因形成于主要断裂点（M-BCR位点）或次要断裂点（m-BCR位点） 。 双色双融合探针（DF） ：只可检测是否有BCR/ABL融合基因，不能区分主次断裂点。,1. ES探针 可区分BCR/ABL融合基因形成于主要断裂点或次要断裂点，用于初诊和指导格列卫用药。异常结果

11、显示为两红、一绿、一黄荧光信号。,在典型的阳性细胞中，如果有BCR/ABL融合基因且BCR断裂位点为M-BCR，其信号类型体现为2R1G1F；断裂位点为m-BCR，其信号类型体现为1R1G2F（其中一个融合信号中的绿点相对较小）；无BCR/ABL融合基因，其信号类型体现为2R2G。,2. DF探针 只可检测是否有BCR/ABL融合基因，不能区分主、次断裂点，可用于治疗效果监测及用药指导。异常结果显示为一红、一绿、两黄荧光信号。,BCR/ABL融合基因检测意义 辅助诊断CML NCCN肿瘤学临床实践指南（2010年第二版）指出，BCR/ABL融合基因阴性的患者不是CML。这些患者的预后比BCR/

12、ABL融合基因阳性的患者明显差。因此，对于BCR/ABL融合基因阴性的患者需要进一步考虑其他疾病。 指导格列卫使用 格列卫是在研究出CML患者高表达BCR/ABL融合基因蛋白产物的基础上，进一步研发出的特异性抑制BCR/ABL融合基因产物的分子靶向药物。采用FISH技术对CML患者BCR/ABL融合基因进行检测，一旦确定了BCR/ABL融合基因的存在，就可以考虑使用格列卫进行治疗。 药物使用效果评估 骨髓移植效果评估 鉴别诊断：鉴别CML急变和AL BCR/ABL融合基因检测显示，AL的BCR/ABL融合基因由次要断裂点断裂形成，CML急变患者的BCR/ABL融合基因由主要断裂点断裂形成。检测

13、BCR/ABL融合基因，区别其主要断裂点和次要断裂点，达到鉴别诊断的目的。,ASS基因异常检测 ASS为精氨基琥珀酸合成基因,位于9q34.1。 ASS基因检测意义：评估CML患者预后 9-28CML患者伴有含ASS基因的9q34区段的缺失，此种患者预后差，慢性期易急变。,3、急性原始粒细胞白血病部分分化型（M2）检测 检测位点： AML1/ETO融合基因。 推荐样本：骨髓,AML1/ETO融合基因：竞争性抑制AML1靶基因的活化，干扰细胞正常的增殖与分化。,AML1,ETO,AML1/ETO融合基因检测意义 辅助诊断M2型AML AML1/ETO融合基因可见于92%的M2型AML患者中，特别

14、是和我国首先提出的M2b型密切相关。 判断预后 AML1/ETO融合基因阳性是预后好的标志，患者对治疗反应佳，完全缓解率可达90%，5年无病生存可达50%-70%。,4、急性早幼粒细胞白血病（M3）检测 检测位点：PML/RARA融合基因。 推荐样本：骨髓,PML基因：早幼粒细胞白血病基因，位于15号染色体上。,RARA基因：维甲酸受体基因，位于17号染色体上。,15号染色体和17号染色体发生特异位点的断裂易位，形成PML/RARA融合基因，此融合基因可以抑制正常的RAR基因功能，从而阻断早幼粒细胞的进一步分化成熟，产生大量幼稚的早幼粒细胞，发生肿瘤。,PML/RARA融合基因检测意义 辅助诊

15、断急性早幼粒细胞白血病 PML/RARA融合基因可见于90以上的APL中，成为APL的一个特异标志。 指导全反式维甲酸（All trans-retinoic acid，ATRA）用药 ATRA治疗APL的主要机制是靶向降解PML/RARA融合蛋白，促进阻滞在早幼粒细胞阶段的白血病细胞分化成熟。 ATRA是治疗APL的首选药物,缓解率能达90% 。,5、粒-单核细胞白血病检测 检测位点： CBFB基因断裂重组。 推荐样本：骨髓,CBFB基因（Core binding factor ，CBFB）：核心结合因子 ,位于16号染色体上。,CBFB也是早期造血所必需的转录因子，通过与AML1的Runt同

16、源结构域结合，由AML1将其带至胞核，增强AML1与DNA的结合能力，使AML1依赖的基因转录得以进行。,CBFB基因断裂重组检测意义 辅助诊断M4型AML CBFB基因断裂重组是AML的特征性染色体异常，占总AML患者的5%-10%和23的M4患者，通常见于AML-M4E0亚型。现在认为CBFB基因断裂重组是M4E0特征性的遗传学改变。 评估预后 CBFB基因断裂重组的AML患者对化疗敏感、预后较好。,6、小儿急性淋巴细胞白血病检测 急性淋巴细胞白血病是儿童中发病率最高的恶性肿瘤，我国l5岁以下小儿白血病的发病率为2.73/10万。 儿童急性淋巴细胞白血病在儿童白血病中占75%之多，是儿童白

17、血病中最常见的类型。 探针介绍：,4、10、17号染色体检测 儿童ALL约25%有染色体数目增加，以4、10、17号染色体受累较为多见。 4、10和17染色体三体是独立的预后良好的指标，这类患者7年EFS大于90%。 TEL/AML1融合基因检测 TEL/AML1在儿童ALL中的发生率高达20-25，是目前儿童ALL最常见的染色体重排。但由于t(12;21)十分微小，不易被常规细胞遗传学发现。 大多数研究发现TEL/AML1阳性的儿童ALL治疗效果很好，5年EFS和总生存率达到89和97，是预后良好的指标之一。 MLL基因断裂重组检测 MLL基因改变在急性白血病中的发生率约为510，在婴儿AL

18、L中则高达79，是预后不良的标志。 BCR/ABL融合基因检测 BCR/ABL融合基因占儿童ALL的35，是最重要的预后不良因素之一。一旦检测出BCR/ABL融合基因，患儿需接受更为强烈的化疗或造血干细胞移植。但大多数患儿仍会治疗失败，5年EFS只有28.6。,临床意义 预后评估 TEL/AML1基因融合或4、10、17号染色体三体的患者预后较好； MLL基因重排的患者预后较差； BCR/ABL基因融合的患者预后非常差。,美国儿童肿瘤组（Children oncology group, COG）根据发病年龄、初诊白细胞数、染色体和融合基因、初诊时CNS或睾丸白血病以及诱导化疗的骨髓原始幼稚细胞

19、比例或MRD水平，将儿童ALL分为低危t(12;21)/TEL-AML1或4、10、17号染色体三体、标危、高危（MLL重排）和高高危t(9；22)/BCR-ABL4组。,骨髓增生异常综合征FISH检测,骨髓增生异常综合征（MDS）是一组起源于造血干细胞，以血细胞病态造血、高风险向急性白血病转化为特征的难治性血细胞质、量异常的异质性疾病。 发病率：3/10万 分类：难治性贫血（RA） 难治性贫血伴环形铁粒幼细胞（RARS） 难治性血细胞减少伴多系发育异常（RCMD） 难治性贫血伴原始细胞增多（RAEB） 骨髓增生异常综合征，无法分类（MDS，U） 5q-综合征（MDS，5q-）,临床症状及转归

20、,20%的MDS患者死于感染,MDS 染色体核型预后分组,MDS染色体及基因异常FISH检测探针,适用人群： 临床经常规检测排除常见原因导致的贫血，需经骨穿进一步诊断的患者。 需借助细胞遗传学异常确诊的可疑MDS患者 临床已经诊断为MDS，需结合遗传学异常判断预后的患者。,临床意义 鉴别诊断 染色体异常是MDS与其他非克隆性血液系统疾病所致贫血如再生障碍性贫血、缺铁性贫血、巨幼细胞贫血等鉴别诊断的主要依据之一。 辅助诊断MDS MDS患者存在的克隆性染色体异常多为缺失性改变， 40%-70%的MDS患者可有细胞遗传学异常，以-5/5q-、-7/7q-、+8、20q-最为常见。 染色体异常是MD

21、S维也纳诊断标准的三大确定标准之一。根据建议，MDS诊断满足两个必要标准和一个确定标准即可。 预后评估，指导临床个体化治疗 正常核型、5q-、20q-、-Y的MDS患者预后较好； -7/7q-、复杂异常的MDS患者预后差； 低危组MDS采用促进造血、诱导分化和生物反应调节剂; 高危组MDS采用AML的联合化疗方案和造血干细胞移植。,性染色体检测,用于监测异性异基因造血干细胞移植效果,男性患者骨髓移植前 男性患者骨髓移植后,探针：CSP X/CSP Y,淋巴瘤FISH检测,FISH检测结果统计,FISH-MDS,在113例MDS确诊病例中，FISH检测发现26例存在染色体异常改变,MDS（FIS

22、H）检测报告单 姓名： 年龄： 性别： 病例号： 申请单号： 科别： 标本种类： 临床诊断： 送检时间：,CSFIR/D5S23探针 EGR1/D5S23探针 D7S486/CSP7探针 （5q33红/5p绿） (5q31红/5p绿) （7q31红/CSP7绿）,D7S522/CSP7探针 X/Y探针 D20S108/CSP8探针 （7q31红/CSP7绿） （X绿/Y红） （20q12红/CSP8绿）,结果分析：本次试验分别计数200个细胞，各异常细胞百分比分别为：GLP CSFIR探针： 50%，GLP D5S23探针：0%；GLP EGR1探针： 50%，GLP D5S23探针：0%；G

23、LP D7S486探针：0 %，CSP 7探针：0%；GLP D7S522探针：0%，CSP 7探针：0 %；GLP D20S108探针：0 %，CSP8探针：0%；CSP X：0%，CSP Y：0%。 实验诊断提示:46，XX,5q-， 请结合其它检测结果和临床症状综合判断。,FISH检测结果统计,FISH-CML (BCR/ABL ),FISH-IGH,BCR/ABL（FISH）检测报告 IGH基因（FISH）检测报告,结果分析：本次试验分别计数200个细胞，异常细胞百分比为90%。检测值阈值(5.0%)，判定为阳性结果。 实验诊断提示：该标本检测到BCR/ABL基因融合比例为90%（主要断裂点），请结合其它检测