第七章-工业微生物诱变育种.ppt

1、第七章 工业微生物诱变育种,基本步骤 原种（出发菌株）纯化斜面同步培养离心洗涤振荡打散过滤菌悬液诱变处理平板分离斜面（活菌计数）（变异率）（初筛） 斜面 斜面性能鉴定（复筛）（再复筛） 保藏及扩大试验,筛选菌种,基因型改变,产量评估,工业微生物中过程的三个阶段：,工业微生物诱变育种的意义： 1、提高有效产物的产量； 2、改善菌种特性、提高产品质量； 3、简化工艺条件； 4、开发新品种。,第一节 诱变育种的试验设计和准备工作,诱变的结果是产生变异，负变机率高于正变。高产突变型是多基因决定，需要多代诱发突变逐渐积累。 诱变育种工作包括：诱发突变、突变株的筛选和高产突变株最佳环境条件的调整。 在诱变

2、育种前，应该对大生产的设备和工艺具有相当的知识和全面的了解。 诱变的工作量大，周期长,事先要做好充分的准备。,一、诱变前对出发菌株的了解,1. 区分不同菌落类型 土霉素产生菌的菌落,土霉素产生菌不同菌落类型的形态及在不同培养基中的效价,2. 出现不同菌落类型原因 遗传因素造成的菌落变化 非遗传因素造成的菌落变化：培养基组成；培养基来源与质量；平板厚度；菌落密度；菌的不同的生长阶段。,二、全面了解菌种特性及其与生产性能的关系,考查生活史：如土霉素菌种原先要培养12d其实是包含了三代的生活周期。各代高产性能不同。 研究菌种的某些生物学特性与产量合成的相关性：顶头孢菌素C的产量，随着其产生菌顶头孢霉

3、菌的节孢子体积增大或数量增加而提高。 考察菌落大小和颜色，如灰黄霉素产生菌荨麻青霉紫色素越深，灰黄霉素产率越低。,三、了解影响菌种生长发育的主要因素,1、培养基的选择 2、培养基斜面制备技术 3、接种密度 4、培养温度 5、培养湿度 6、试剂和原材料质量,如刺孢小单孢菌产生的庆大霉素，其中的C1是有效的，C2是无效的，培养基中加入适量的磷和蛋白胨及加大通风都有利于C1的合成，反之，C2的比例就上升。,四、了解产物各组分与培养条件的关系,五、快速准确的检测方法,建立一个适应于大规模筛选的有效检测方法是减少诱变选育工作量的关键。,分光光度法,液相色谱法,气相色谱法,薄层层析法,化学滴定法,六、最佳

4、的菌种保藏方法,事先要建立一个最佳的培养基、培养条件和适宜的保藏方法，否则将前功尽弃。,第二节 诱变育种的步骤与方法,诱变育种的优缺点 优点：方法简单、投资少、收获大； 缺点：缺乏定向性。 诱变育种的步骤和方法： 出发菌株的选择单孢子菌悬液的制备诱变剂及诱变剂量的选择诱变的处理方法纯化分离等。,一、出发菌株,1、对一般出发菌株的要求 用作出发菌株有：野生型菌株、生产菌株、具有利性状菌株、经过诱变的菌株、增变菌株等。 一般要求生长快，营养要求粗放，产孢子多，对诱变剂敏感性高，已能积累少量产品或前体物的菌株。 2、选择具有一定生产能力或某种特性的菌株 选择适于发酵设备条件的生产菌株便于推广。 3、

5、选择纯种 单倍体、单核或少核。,4、菌株的稳定性 挑选合成能力强，遗传性状稳定的菌株。 5、连续诱变育种过程中出发菌株的选择 挑选每代诱变处理后具有一些表型改变的菌株。 6、选择出发菌株的其他因素 如孢子多、不产色素、生活能力强、生长速度快、糖氮利用快、耐消泡、粘度小等性状的菌株。 7、采用多出发菌株 选择3-4株出发菌种同时诱变。 8、了解菌种代谢特点 了解菌种的代谢特点有助于选择有效的出发菌株，如肌苷酸产生菌。,二、出发菌株的纯化,菌种纯化的方法： 1. 划线分离法 2. 稀释分离法 3. 显微镜操纵器分离单孢子,三、单孢子或单细胞悬液的制备,制备菌悬液时要注意生理状态、均一性、细胞浓度、

6、菌悬液介质（生理盐水或缓冲液） 1、孢子或菌体要年轻、健壮 采用分散法制备，力求90以上为单孢子。 菌悬液浓度用平板计数、血球计数器计数和光密度法测定。菌悬液的浓度，要求霉菌孢子约为106个/mL，放线菌的孢子浓度约为106-107个/mL ，细菌的细胞浓度为107-108个/mL。,2、菌悬液制备方法 产孢子的菌类：放线菌，霉菌应处理孢子。放线菌和霉菌的孢子要稍加萌发后使用。 细菌：生长指数期，最好在诱变处理前进行摇瓶振荡预培养，尽可能获得同步培养物。 某些不产孢子的真菌：菌丝体，最好采用年幼的菌丝体进行诱变处理。获得的方法：菌丝尖端法、处理单菌落周围尖端菌丝法和混合处理法。,菌丝尖端法,枯

7、草杆菌黑色变种芽孢菌悬液：试验菌液用2%蛋白胨配成3-4105个/mL浓度共50ml。 金黄色葡萄球菌菌悬液：为24小时普通琼脂斜面培养物，用5.5mL灭菌的0.03M磷酸盐缓冲液洗下来，然后取5mL置于装有10mL的0.03M磷酸盐缓冲液中，通过比浊法将菌液用2%蛋白质配制成4-6105个/mL共50ml为试验用。,3、制备原生质体作诱变剂 优点： （1）异质体（丝状真菌菌丝有不同分化程度） （2）无细胞壁的阻挡（细胞壁会吸收诱变因子能量，去壁菌对诱变剂敏感） （3）增强不产孢子的丝状菌诱变效应,四、诱变剂及诱变剂量,（一）诱变剂种类的选择 取决于诱变剂对基因作用的特异性和出发菌株的特性。

8、产量由多基因决定，并且菌体自身也有修复能力。 因此，诱变剂的诱变作用，不仅取决于诱变剂的种类选择，还取决于出发菌株的特性及其诱变史。,1、诱变剂的选择 作用机制、菌种特性。 紫外线（形成嘧啶二聚体），5BU（在复制过程中取代DNA分子上相同结构的碱基成分），亚硝酸（作用在嘌呤和嘧啶碱基上） 2、根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂 遗传稳定的出发菌株：强诱变剂 遗传不稳定的出发菌株：先纯化，再用温和诱变剂处理。,3、参考出发菌株原有的诱变系谱 敏感：有的菌株对某一种或某一组合诱变因子敏感。 饱和现象：对诱变史很长的高产菌株来说，长期多次用某一诱变因子会产生钝化反应。 常规做法：几种诱变剂，各取

9、不同剂量做一系列诱变实验，筛菌，测定生产能力。,（二）最适诱变剂量的选择,剂量：以诱变剂浓度和处理时间来表示。 合适剂量：应该使所希望得到的突变株在存活群体中占有最大的比例。 最适剂量：能扩大变异幅度又能促使变异移向正向突变范围的剂量。,紫外线致死率曲线,急性效应：高剂量率照射，短时间内达到较大剂量，效应迅速表现。 慢性效应：低剂量率长期照射，随着照射剂量增加，效应逐渐积累，经历较长时间表现出来。 剂量的大小常以致死率和变异率来确定。,诱变剂对产量性状的诱变作用趋势： 处理剂量大，杀菌率高，在单位存活细胞中负变菌株多，正变菌株少。 经长期诱变的高产菌株，正突变率的高峰多出现在低剂量区，负变率在

10、高剂量时更高。 诱变史短的低产菌株，正变株的高峰比负变株高得多，小剂量诱变处理时正突变株多。,诱变剂的剂量选择经验,经长期诱变的高产菌株：低剂量处理。 遗传性状不太稳定的菌株：用较温和的诱变剂和较低的剂量处理。 要筛选具有特殊性状或较大幅度提高产量的菌株：可以用强诱变剂和高剂量处理。 诱变史较短的野生低产菌株：开始宜采用较高剂量，而后逐步用温和诱变剂低剂量处理。 多核细胞菌株：较高剂量处理。,诱变剂量的控制,1. 化学诱变剂：调节诱变剂的浓度、处理时间和处理条件（温度、pH值等）； 2. 物理诱变剂：控制照射的距离、时间和照射过程中的条件（氧气、水分等）。,五、诱变剂的处理方式,1. 单因子处

11、理 使筛选工作简单化，但突变率低，突变类型少。 2. 复合因子处理 能导致较大的突变，适合遗传性稳定的纯种及生活能力强的菌株处理。,复合因子诱变的处理方式：,（1）两个以上因子同时处理； （2）不同诱变剂交替处理； （3）同一种诱变剂连续重复使用； （4）紫外线光复活交替处理。,3. 诱变处理的方式,（1）菌体直接处理：菌体有诱变剂接触后再进行平板分离。 （2）平板处理：诱变剂加入到培养基中。 （3）摇瓶振荡培养处理：诱变剂加入到摇瓶培养基中。,六、影响突变率的因素,（一）菌种遗传特性不同 5-BU对静止或休眠细胞不起作用；紫外线、电离辐射、烷化基、亚硝酸等对分裂细胞和静止孢子都有效。 （二）

12、细胞壁结构 丝状菌孢子壁较厚，表面蜡质也会阻碍诱变剂渗入。或需用洗衣粉、脂肪酶、表面活性剂等处理去除蜡质。,（三）环境条件的影响,1、诱变前预培养和诱变后培养 预培养：培养基中加入咖啡因、蛋白胨、酵母膏、吖啶黄、b重氮尿嘧啶、嘌呤等物质能提高突变率。 后培养：诱变后的菌悬液不直接分离于平板，而是立即转移到营养丰富的培养基中培养数代。作用是让突变体重新调节代谢平衡，避免突变体表型延迟现象。,2、温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响 化学诱变因子: T，速度。 最适pH：避免诱变剂分解而失去诱变效应。 辐射因子、紫外线：氧气充足有利于突变发生。 3、平皿密度效应 密度要适中，不能过密。,第三

13、节 突变株的分离与筛选,随机筛选：过去采用，是盲目的选择，效率低。 定向筛选：现在，筛选效率高。,出发菌株,正突变型,负突变型,稳定型,死亡,存活,如何筛选？,抗性突变株和营养缺陷型突变株可用选择性培养基筛选，但产量突变株在表现上难以区分。 原因：高产突变频率低，产量提高幅度不大，5% 15%，实验误差约有10%左右。 策略：初筛（多）和复筛（精）,一、诱变育种的基本环节,常规法：摇瓶 简便法：琼脂块法摇瓶,二、筛选的程序,1. 常规筛选程序,2. 简便筛选程序,突变类型：形态突变和生化突变 高产突变株频率低，实验误差又在所难免，因而筛选工作常采用多级水平筛选，有利于获得优良菌株： 多级水平筛

14、选： 平板筛选（510，200株） 摇瓶初筛（2530，50株） 摇瓶复筛（15，13株）,三、分离与筛选的方法,（一）随机筛选 随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选。 优点：与大生产条件相近。 缺点：工作量大。 如果突变频率为1%，那么要初筛挑选的菌落起码要200个。,（二）平板菌落预筛,大量菌落经过平板预筛，可保留510的初筛菌株，再进行摇瓶发酵复筛，复证被筛菌株的重演性。 1、根据形态筛选突变株 菌落形态变化 红霉素产生菌诱变后的突变株若带色素则多为低产菌株；产孢子菌株变异后不产孢子也应弃选。 较高产量的出发菌株诱变后，菌落形态变化剧烈的多是负变株，高产突变株一般变化较小。,2、根据平板菌落生

15、化反应筛选变株 通过琼脂平板上的透明圈、变色圈、抑菌圈生长圈等生化反应筛选。,3、采用冷敏感菌筛选抗生素变株 低温敏感菌变异株：冷敏菌在20不能生长，在37最适，产抗生素放线菌可在20生长。 冷敏感菌和诱变菌孢子混合先20条件下培养，待产抗生素的放线菌长出后，转移到37的条件下培养，冷敏菌迅速生长，抗生素产生菌菌落周围因由抗生素而不能生长，根据菌落直径与抑菌圈直径之比的有效值，可以直接筛选出抗生素的高产突变株。,4、浓度梯度法 合成抗生素的水平与其耐自身产物能力相关。,5、应用复印技术快速筛选变株 产脂野生株、具有高脂含量的突变株。 方法：筛选培养基 复印 苏丹黑染色洗去多余染料酒精脱色干燥显

16、色选择深蓝色或紫色的菌落。,6、琼脂块大通量筛选变株 适用对象：抗生素、酶类产物。 优点：效率提高15-20倍。 缺点：产物浓度高时易漏筛，培养条件与发酵条件差距大。 方法：琼脂块扩散圈和溶剂抽提法。 准确性：较直接分离在平皿上判断活性法要准确。,四、摇瓶液体培养,优点：通气量足，溶氧好，培养条件接近于发酵罐。 缺点：工作量大，效率低， 方法：初筛：一个菌株接种一个摇瓶；复筛：一个菌株接种3-5摇瓶。,五、产物活性测定,常规检测方法：如蛋白酶采用分光光度法；脂肪酶采用NaOH滴定法，精确但繁琐。 为了扩大筛选量，缩短每次处理的周期，提高筛选速度提高，必须建立一个简便、快速、准确的测定方法。,1

17、、琼脂平板活性圈法 活性圈的大小（琼脂块或抑菌圈水解圈） 2、纸片法 发酵液浓度较高时，可将其置于滤纸片上，覆于含底物的平板上。 3、琼脂薄层纸片法 孢子悬液与琼脂混合倾倒至玻璃板制成薄层琼脂板，待检发酵液加到滤纸上覆于琼脂薄板上，观察孢子萌发情况。 用于抗真菌抗生素、农业抗生素野生菌。,六、摇瓶数据的调整和有关菌株特性的观察分析,菌株产量检测中的误差来源： 1. 摇瓶培养条件变化影响遗传特性的表达。 2. 检测过程中的误差。 对摇瓶发酵液测试数据要尽量应用生物统计方法来处理，掌握数据的真实情况。 在分离筛选中，要始终密切观察菌株的生长特性。,七、培养基和培养条件的调整,环境的选择作用：表型=

18、环境+基因 当筛选到一个优良的菌株时，要改变环境条件，即调整培养基的组成和培养条件，使突变株处于一个适应的环境中得到充分表达的机会，使高产的性状及其他优良特性完全发挥出来。,八、变种的特性研究与鉴定,考察菌株的生物学特性； 考察菌株的发酵特性； 考察菌株的产物的化学特性； 4. 从分子水平上进一步考察其生理生化特性 5. 采用适宜的保藏方法，中试放大以及投产。,九、诱变育种实例,（一）碱性脂肪酶高产变株FS1884的选育 1.原生质体作为诱变材料 2.采用定向控制的理性筛选抗阻遏和解除反馈抑制筛选模型 3.初筛采用大通量的琼脂块法 4.结合饰变育种,（二）灰黄霉素耐前体变株D-756的育种,（

19、1）培养基：用大米代替乳糖和玉米粉 （2）诱变剂筛选：紫外线氯化锂 （3）挑菌标准：浅色菌丝,第四节 营养缺陷型菌株的筛选,野生型菌株：从自然界分离到的未经诱变的原始菌株。 营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养（氨基酸、维生素、核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。 原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组变异后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。,相关培养基,基本培养基(MM) -,完全培养基(CM) +,补充培养基(SM) A、B,三类遗传型,野生型 A+B+,营养缺陷型型 A+B-,原养型 A+B+,一、营养缺陷型菌株的分离和筛选,

20、一般包括诱发突变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型、鉴别缺陷种类。 （一）营养缺陷型的诱发 突变类型：单一基因突变 诱变剂：亚硝基胍、紫外线、亚硝酸,（二）淘汰野生型菌株,抗生素法： 菌丝过滤法 3. 高温杀菌法：,1. 抗生素富集法,完全培养基后培养,基本培养基饥饿培养,基本培养基+抗生素培养,平板分离,2. 菌丝过滤法,真菌和放线菌的野生孢子在基本培养基中能萌发生长成菌丝，而营养缺陷型的孢子不能萌发，经过过滤，除去野生型。,3. 高温杀菌法,利用芽孢菌类的芽孢和营养细胞对热敏感性的差异，让诱变后的细菌形成芽孢，然后把处在芽孢阶段的细菌转移到基本培养基中，培养后野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不萌

21、发。,（三）营养缺陷型的检出 1. 点植对照法 2. 影印法 3. 夹层法 4. 限量补充培养法,1. 点植对照法,2. 影印法,MM CM,3. 夹层法,4. 限量补充培养法,就是在分离平板培养基中限量添加缺陷型菌株所需要的营养物质，菌落生长后，野生型菌落大，而缺陷型的菌落小。如培养基中添加0.01%的蛋白胨或其他某种单一的氨基酸、维生素或碱基等。,（四）营养缺陷型的鉴定,确定菌株属于哪一类营养缺陷型或缺哪一种营养因子. 1、鉴定方法 （1）一种营养因子，多株菌； （2）一个菌株，多种营养因子（生长谱法）。,2、鉴定步骤 测定缺陷型菌株所需生长因子的类别 具体测缺陷该类别物质中的哪种因子 用

22、单一生长因子复证试验 （1）缺陷型类别的测定 氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨：氨基酸； 酵母浸出液：氨基酸、维生素、碱基混合物； 维生素混合物：维生素； 核酸碱基混合液或酵母核酸水解物：碱基。,营养缺陷型类别测定,氨基酸+维生素缺陷型,氨基酸缺陷型,嘌呤嘧啶缺陷型, 酪素水解物； 酵母浸出液； 维生素混合物； 核酸碱基混合液或酵母核酸水解物。,（2）缺陷型所需生长因子的测定,分组测定法，提高测定效率。,二、营养缺陷型突变株的应用,1. 工业育种：协助解除代谢反馈调控机制，从而达到大量累积产物的目的，如氨基酸的发酵。 2. 遗传标记：菌种杂交、重组育种时作为遗传标记。,第五节 温敏突变株的筛选

23、,一、特性 TS突变株：对温度敏感的条件致死突变。 突变类型：错义突变： 生化特性：酶活力受温度控制，,二、温敏突变株的筛选方法,（一）温敏突变株的诱发 诱变剂：亚硝基类、磺酸酯类、亚硝酸、紫外线等，诱变处理的方法同常规育种基本相同。 突变频率仅有0.01%左右。,（二）富集,1、抗生素法：非许可温度下，抗生素杀死野生菌。 2、物理方法：过滤或离心法。 3、H3(氚)-前体法： 例如筛选RNA合成缺损的TS突变株，在诱变后用菌体在非许可的温度下培养，并且加入放射性同位素H3，TS菌株不生长，野生型菌株生长并吸收H3而死亡。,（三）分离筛选,1、常规法：影印到CM和MM，适温和非许可温度下培养,

24、2. 特殊分离筛选方法,根据发酵产品需要，灵活地设计富集方法和平板培养基组成，可以获得具有特定性能的TS突变株。,三、温敏突变株在发酵工业中的应用,1、在谷氨酸的发酵中的应用 筛选细胞膜结构或功能缺损的TS菌株，通过调节温度来控制细胞膜透性。 2、在丝氨酸的发酵中的应用 甲醇代谢缺损兼温敏株，在许可温度下丝氨酸酶具有正常的降解活力，能利用甲醇生长，非许可温度下，丝氨酸酶失去降解作用，因而细胞大量分泌丝氨酸。 3、微生物单细胞蛋白的生产 筛选温敏突变株，可在非许可温度下沉降或自溶。,第六节 抗噬菌体菌株的选育,噬菌体,一、烈性噬菌体及其效价的测定,1、重层琼脂法：弥补平皿底面不平，使噬菌斑较大。

25、 2、单层平板法：只求验证是否存在噬菌体，不求计数。 3、快速测定法：低浓度琼脂，借助放大设备，适合工业发酵中早期检测。 4、斑点试验法：将宿主菌涂布平板，不同稀释度待测试样点于平板，培养后，根据噬菌斑形成与否判断噬菌体效价。,二、温和性噬菌体及溶源菌,温和性噬菌体：能导致溶源性反应噬菌体。 状态：a、胞外游离的病毒粒子。 b、原噬菌体（prophage)： 即整合在宿主DNA上的或附着在宿主 细胞内的pDNA。 c、营养期的噬菌体，可产生噬菌体DNA 和蛋白质。,三、抗噬菌体菌株的选育,1、专一性噬菌体获得和纯化 2、高效价噬菌体原液的制备 3、噬菌体原液效价测定 4、菌株诱发突变和分离 5

26、、液体摇瓶振荡培养 6、抗性菌株对周围环境中存在的各种噬菌体的抗性,四、抗性菌株的特性研究,1、抗性菌株稳定性试验 2、抗性菌株的产量性能,五、抗噬菌体菌株选育的实例,1、菌种 2、培养基成分 3、噬菌体的分离纯化和原液制备 4、噬菌体菌株的选育 5、菌株抗噬菌体性能的检验 6、摇瓶发酵试验 7、发酵罐发酵试验,第七章 微生物发酵过程优化的方法,选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度(便于下游处理)、较高的底物转化率(降低原料成本)和较高的生产强度(缩短发酵周期) 。 发酵过程优化的目标 使细胞生理调节、细胞环境、反应器

27、特性、工艺操作条件与反应器控制之间这种复杂的相互作用尽可能地简化，并对这些条件和相互关系进行优化，使之最适于特定发酵过程的进行。,一、单因素实验,1、定义 实验中只有一个影响因素，或虽有多个影响因素，在安排实验时，只考虑一个对指标影响最大的因素，其它因素尽量保持不变的实验，即为单因素实验。 2、步骤 1）确定试验因素的取值范围 x：实验点 axb 2）确定指标 3）根据实际情况及实验要求，选择实验方法，科学安排实验点,单因素实验的缺陷,单因素试验法是以因素间没有交互作用为前提，对于大多数培养基组成而言，这种假设往往不成立，采用该法可能导致错误的结论。如果考查多因素的影响，按单因素去进行实验，就

28、需要很长的时间和大量的劳动，本课程介绍2种实验设计方法。,二、正交试验,在生产实践中，试制新产品、改革工艺、寻求好的生产条件等，这些都需要做试验，而试验总是要花费时间，消耗人力、物力。因此，试验的次数应尽可能少。,全面试验： 如 4 个 3 水平的因素，要做 3481 次试验； 6个5 水平的因素，要做 5615625次试验。非常困难。,能否减少试验次数，而又不影响试验效果呢？,因素与水平表,正交表记为 Ln（mk），m是各因素的水平，k （列数）是因素的个数，n 是安排试验的次数（行数）。,L9（34）4因素3水平正交试验，共做9次试验，而全面试验要做 34=81 次，减少了72次。 L25

29、（56） 6因素5水平正交试验，共做25次试验，而全面试验要做 56=15625 次，减少了15600次。,1. 正交表及其用法,正交表的记号：L9（34）表示 4 个因素，每个因素取 3 个水平的正交表。,L9（34）正交表,L9（34）正交试验方案,2. 正交试验的设计方案,（1）确定试验的因素和各因素的水平,3. 实施试验方案,4. 结果分析,三、响应面设计,响应面方法（Response Surface Analysis，简称RSA）是利用合理的试验设计并通过实验得到的一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。 Y=C1+C2X1+C3X2+C4X3-C5X12-C6X1X2+C7X1X3-C8X22+C9X2X3-C10X32,响应面方法它可用在以下3个方面： 描述单个试验变量对响应值的影响； 确定试验变量之间的相关关系； 描述所有试验变量对响应值的综合影响。,1. RSA的步骤,(1) 确定因素 ：就是研究范围内主要影响加工过程和产品质量的重要因素。当然假设实验者已经知道这些因素是什么。 (2) 确定因素水平 ：通过做单因素试验或由样品的特性和工艺来确定因素水平的范围。 (3) 确定实验点 ：采用适当的试验设计，确定实验的试验点。 (4) 数据分析 ：用适当的统计