透射电镜的样品制备技术.ppt

1、a，1，透射电子显微镜的生物样品制备技术，a，2，可分为两类：透射电子显微镜样品的基本制备技术-超薄切片技术-负染技术，生物样品的特殊样品制备技术，a，3，超薄切片技术，a，4，概念：指厚度小于100纳米的切片技术的制备。特点：它是透射电子显微镜制备生物样品最常用和最基本的技术；是其他技术方法的基础；手术时间长，操作复杂而精细。生物医学样本的特征：1。样品多样化，包括组织、细胞、微生物和生物大分子。2.含水量高，质地柔软，脱水时容易收缩变形。3.机械度低，抗电子束轰击能力差。4.它们大多数由低原子序数的元素组成，所以导电性差。5.样品形态对试剂的酸碱度和温度敏感。a、6、主要步骤：固定、脱水、

2、浸泡和染色包埋切片；a，7，1。从人体、动植物、细胞和微生物的培养物中选择电子显微镜观察材料的过程。从活体取样时，应做到：快速-在1 2分钟内将固定液放入体外-准确取样，代表性小-1毫米1毫米，太小时结构少，太大时固定不充分，结构保存不良-动作轻，仪器尖锐而冷-0 4，仪器、容器和固定液预冷，固定a、8、 2目的尽可能保持组织和细胞在生活条件下的结构，以固定细胞中的各种成分，避免在后续的洗涤和脱水步骤中溶解和损失，防止细胞内酶活性引起的细胞自溶，防止外部微生物入侵和繁殖引起的腐败，从而破坏微细细胞的超微结构。 方法物理法、快速冷冻干燥法、化学法、浸渍固定法、原位固定法、灌注固定法、a、10、普

3、通固定剂、戊二醛(GA)无色透明液体，pH4，使用浓度2.5 4%，使用温度4。优点：渗透性强，能更好地保存蛋白质和碳水化合物的结构及酶的活性，固定保存时间长(4下可达几周至几个月)。缺点：差的组织对比度对脂质没有固定作用。固定后，应彻底清洗样品。一、11、四氧化锇OsO4，浅黄色块状晶体，使用浓度1 4%，使用温度4。优点：对蛋白质和脂类有良好的固定效果，可避免组织块的收缩或膨胀，产生明显的反差。A，12，四氧化锇OsO4，缺点：分子量大，渗透能力差，对碳水化合物和酶的固定效果差，固定时间长，容易引起组织脆化，刺激性味道强，对角膜和鼻粘膜有毒性作用，在光热作用过程中容易发生变化；A，13，多

4、聚甲醛(多聚甲醛)，白色粉末，当其以4%的浓度使用时，具有对组织渗透性强和保存抗原物质的优点，主要用于免疫电子显微镜。缺点是当浓度高时，组织结构可能会丢失，并且它们中的大多数不能单独使用。a，14，普通缓冲液，0.2M磷酸盐缓冲液：比0.2M二甲基砷酸盐缓冲液：更常用于制备固定液和冲洗，用于电子显微镜细胞化学。a、15、浸泡固定法是一种将样品直接固定在预冷的固定液中的方法，适用于大多数组织和器官。最常用的方法是戊二醛和锇酸固定。手术前固定步骤3360:用2.5%-4%的戊二醛在4下冲洗1-2小时或数月：用4的缓冲液更换2-4小时，共3次，然后固定：用1%的锇酸在4下冲洗1.5-2小时(培养细胞

5、30分钟)，用蒸馏水在4冲洗10分钟，a，16，原位固定法，以保证器官的血液供应，避免缺血引起的组织损伤或自溶。操作步骤：在麻醉后保持血液供应的情况下，解剖时最好在取样部位局部加入固定液，直至组织达到适当的硬度。一、一、十七、灌注固定是指灌注的方法包括全身灌注固定(对于小动物)和器官灌注固定(对于大动物)。a、18、操作步骤(以全身灌注固定法为例)麻醉待灌注的动物，将动物固定在实验台上，打开胸腔暴露心脏，将针刺入左心室，切开右心耳引出血液和灌注液。用注射器或输液器缓慢注入37，0.9%氯化钠，直至内脏血液颜色消失或流出液失去颜色，注入4固定液，待组织变硬后取样。a，19，体外培养细胞的固定，单

6、层细胞的固定，悬浮细胞的固定，添加熔化的2%琼脂或BSA以增加粘附。离心机。a 20 3。脱水的目的是清除组织内的游离水，有利于浸泡和包埋常用的脱水剂乙醇3360，使组织收缩较小，但与包埋剂的混溶性差。丙酮：能溶解脂质，与包埋剂有良好的混溶性，但容易使组织变脆。a、21、脱水步骤，将50%乙醇从低浓度脱水到高浓度，在4脱水10 15分钟，70%乙醇在4脱水10 15分钟或在80%乙醇室温脱水10 15分钟过夜，95%乙醇室温脱水10 15分钟，95%乙醇：95%丙酮(11)室温脱水10 15分钟。15分钟无水丙酮在40分钟室温下，a，22，4。浸泡和包埋，浸泡：目的是使包埋剂逐渐取代脱水剂渗入

7、组织和细胞。由于包埋剂与脱水剂不混溶，因此有必要使用与脱水剂和包埋剂都相容的物质进行转化。常用的转化剂是环氧丙烷。包埋：目的是使包埋剂完全渗入组织细胞，使组织具有一定的硬度、弹性和韧性，并能承受切片时的各种压力，从而制备超薄切片。常用包埋剂，a，23，具有粘度低、亲和力强、切割性能优异、切片透明度高、组织结构保存良好的特点，能承受低温电子束轰击和聚合。环氧树脂Epon812(进口)能很容易地渗透到组织中并保持细胞结构，因此被广泛使用。丙烯酸树脂)618(国产)，a，24，低聚丙烯酸K4M:是一种低温水溶性包埋剂，常用。其特点是在低温(-35)下保持低粘度；它可以在紫外光(波长360纳米)下聚合

8、。聚合后，可在常温下切片；它能保持植物血凝素的组织结构和抗原性以及结合位点，减少背景非特异性染色，因此主要用于免疫细胞化学包埋后染色。包埋剂配方(K4M) K4M(单体)8.65克交联剂1.35克引发剂50毫克，a，25，LR white:是混合丙烯酸类单体，它们在脂质中溶解度低，保存膜结构好，能承受电子束轰击，因此不能用作支撑膜。60热聚合；冷聚合-25，促进剂辅助聚合。a，26，嵌入方法，1。常规包埋法适用于大多数组织块和细胞块在室温下用环氧丙烷浸泡20min，环氧丙烷：包埋剂1:1在室温下浸泡40-60min，包埋剂在室温下浸泡3h，将样品放入包埋板或胶囊中，放置标签并用包埋剂填充进行聚

9、合(硬化包埋剂)35 12h 45 12h 55 12h，a，27，2。冰冻切片、半薄切片和单层培养细胞的某些结构观察。1.组织块：固定后，用振动切片机切成50-100m厚的切片，在显微镜下选择含有所需结构的厚切片进行冲洗。在用1%锇酸固定、用乙醇和丙酮脱水、用环氧树脂浸渍后，将厚片放在载玻片上，将具有平顶的废物包埋块放置在切片的特定部分，然后在60聚合以修整该块，然后常规切片和染色。a，28，2，切片和单层培养细胞(需要在载玻片上进行):选择要在光学显微镜下观察的位置，并用笔在载玻片的反面进行标记。预固定、漂洗、后固定、脱水和浸泡与常规包埋方法相同，但每个步骤的时间可以缩短切片，用途：制备厚

10、度小于100纳米的切片。复合膜载体膜甲醛膜火棉胶膜碳膜用于负染色技术支撑网常用的有铜网、不锈钢网、镍网和铂网(用于组织化学)，a、31、a、32、2。半薄切片：的目的是确定要观察的准确位置，厚度为0.5 1微米，用甲苯胺蓝染色显示。a、34、a、35、a、36、a、37、a、38、超薄切片：采用超薄切片操作步骤：包埋块固定刀固定水箱，加水切片，选择切片和钓鱼切片，a、39、切片带弯曲的可能原因及解决办法，a、40、制作支撑膜，可支撑观察性能良好的支撑膜应具备：1。高透明度2。电子显微镜下无可见结构。不与各种支持样品发生化学反应，如芳华膜、碳膜、火棉胶基碳膜、硝酸纤维素基碳膜、微滤膜等。a、41

11、、支撑膜、防化膜的生产(防化膜的化学成分为聚乙烯醇缩甲醛，为淡黄色粉末):制备炭膜的力学和化学性能较好，热漂移减小。喷膜-浮膜-鱼膜，a，43，切片厚度可根据干涉色判断。深灰色40纳米，灰色40-50纳米，薄，易被电子束破坏，银白色60-70纳米，最常用的金黄色70-80纳米，紫色90纳米以上，厚，细节不明。a，44，超薄切片的质量指标，样品结构保存良好，结构细腻且无损失。切片厚度均匀，厚度在60-90纳米之间。表面没有皱纹、刀痕和震颤。样品对比度好，无染料沉淀。支撑膜的厚度适中，在观察过程中不会发生漂移或破裂。电子染色，即使用重金属盐选择性地与生物样品中的不同结构成分结合，以提高结构成分散射

12、电子的能力，从而增加图像的对比度，也称为阳性染色。常用染料： 0.5% 1%醋酸铀酰能增强核酸、蛋白质和结缔组织纤维的对比度。0.1% 0.4%柠檬酸铅能增强膜结构与脂质的反差。a，46，阳性染色，a，47，透射电镜样品：超薄切片厚度应均匀，无震颤，无刀痕，无染色污染，适当对比，a，48，a，49，阴性染色技术，即重金属盐与结构背景结合，增加背景的电子散射能力，使背景变黑，使样品结构变亮。，a，50，染色磷钨酸(PTA) pH 6.7-7，染色步骤，涂布网，滴加样品，滴加染料溶液1-2分钟，用滤纸吸收染料溶液，观察优点，它适用于悬浮液样品(细菌、病毒、其他微生物、大分子、分离细胞器)，具有操作快速简单、样品用量少、图像结构对比度好等优点。取样：需要精确的零件、小块、短时间、低温、尖锐的仪器和减少的机械损伤。2.戊二醛的固定时间可适当延长，一般不超过一周，在此期间应更换一次固定剂，并保持低温固定，充分清洗后再进行锇酸固定1-2小时，时间不能太长进行酒精梯度脱水，一般为50%、70%、80%、95%、无水酒精；4.样品的渗透和嵌入；保持干燥和彻底渗透；5.聚合：由室温到高温梯度加热，如35，45，60的顺序；6.超薄切片3360切片器的性能切片时要注意载体网的质量。7.在电子染色过程中必须避免一切污染。一、53、注意事项(阴性染色)，样品浓度应适中，无杂质样品的酸碱度应与染