荧光定量PCR在临床医学中的应用

1、荧光定量PCR在临床医学中的应用，内容摘要，1，基因诊断技术简介2，乙型肝炎病原体检测3，丙型肝炎病原体检测4，性病相关病原体检测。基因诊断技术简介，、4基因诊断、3免疫学诊断、细胞膜、细胞核、DNA、转录、MRNA、翻译、蛋白质、1形态学诊断、2生化诊断、概念，PCR及基因诊断技术，基因诊断是通过核酸的分子生物学检查直接检测基因的存在或缺陷来诊断疾病的方法。聚合酶链反应(PCR)，快速扩增DNA。PCR技术通过两个称为引物的短DNA片段和耐热酶的作用，在3小时内将特定DNA片段放大1000万倍。20世纪90年代中期，PCR临床应用在国内正式开始，1998年，荧光定量PCR技术开始在中国用于临

2、床试验。荧光定量PCR技术、实时荧光定量PCR技术将荧光标记放入反应系统中，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标准曲线分析PCR种产品，最终实现未知起始stencils定量分析的技术，是迄今为止已知基因序列中核酸测定最敏感的方法。荧光染料：SYBR Green I，EVA Green fluorescence probe:TaqMan，Hybridization Probes，Molecular Beacon。荧光定量PCR技术的优点，特异性：直接扩增病原体的特定DNA或异常基因片段的敏感度很高：能检测很少的DNA，有效降低误诊率，节省时间：扩大周期短，有助于快速诊断血清、痰、体液、

3、毛发等多种样品。降低污染的数量精确度，而无需PCR后处理。使用标准曲线方法，日志分析自动化程度高。工作安全，避免人类的判断。Roche LightCycler、荧光定量PCR技术的临床应用，病毒肝炎(HBV，HBV-YMDD，HCV)基因检测性传播疾病相关病原体(CT，NG，UU，HPV)基因检测优生优育计划诊断：人类细胞梅葛病毒(HCMV)，检测乙型肝炎的病原体，乙型肝炎病毒，HBV感染过程，乙型肝炎是如何传播的？慢性HBV感染，病毒6个月没有持续的免疫耐受：HBV复制活动免疫消除期非活动或低复制期。慢性乙型肝炎，HBeAg阳性慢性乙型肝炎HBeAg阴性慢性乙型肝炎，乙型肝炎肝硬化，代偿性肝

4、硬化失代偿性肝硬化，HBsAg和抗HBs、HBsAg在感染HBV 2周后可能呈阳性。HBsAg阳性可以诊断HBV感染，阴性不能排除HBV感染。抗hbs是保护抗体，阳性表示对HBV的免疫力。HBsAg和HBs同时是语音。也就是说，叫昌浩。此时不创建HBsAg和HBs。HBsAg和抗HBs同时阳性：HBV感染恢复期，此时HBsAg不会消失，而是生成了抗HBs。可能是亚型感染。为什么HBsAg阴性不能排除HBV感染？昌浩机检测试剂不够敏感的隐匿性慢性乙型肝炎(s基因变异)重叠HCV感染(阻碍HBsAg合成)，抗hbs阳性没事吧？单抗HBs阳性HBV DNA检出率0-11.8%感染了其他HBV亚型HB

5、V病毒s基因变异，血清HBsAg阴性HBV感染如何诊断？利用HBV DNA对突变抗原的检测试剂提高检测灵敏度！HBeAg和anti-HBe、HBeAg的存在意味着病毒复制活跃，传染性强。HBeAg消失，抗HBe生成称为血清转换。抗HBe量旋转后，病毒复制水平低，传染性降低。但是，HBe质子并不意味着病毒复制中断或没有传染性。研究表明，HBV DNA仍可在20%到50%之间检测，部分原因是前c基因变异，可能不会形成HBeAg。，HBeAg和反HBe共存？在血清转换过程中野生菌株和变异体都存在。HBeAg水平与HBV DNA的关系，HBeAg阳性样本HBV DNA检测率约90% hbh beag与

6、HBV DNA的关系，HBeag语音/抗hbe阳性/HBV DNA阳性，HBV DNA水平通常低HBV低水平复制HBV病毒前c区基因变异嵌套HCV感染，“2半”缺陷，“2半”是身体免疫反应状态，间接指标。“带菌者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫指标对体内病毒复制水平和感染程度没有反应。HBsAg语音或HBeAg语音不能排除HBV感染。HBV DNA是病毒复制和传染性的直接标志。HBV DNA量化对判断病毒复制的程度、传染性大小、病毒药物的疗效等具有重要意义。HBV DNA复制=乙型肝炎病毒负载，HBV DNA检测的临床意义，HBV DNA是HBV存在的最直接依据，HBV DNA是有传染性的标记

7、，HBV DNA对乙型肝炎起2/2的补充作用，HBV DNA是判断乙型肝炎抗病毒药物疗效的最敏感指标，它直接提供了HBV DNA检测隐匿性慢性乙型肝炎并缩短“创期”的证据献血者创始人病毒核酸的筛选和早期诊断，HBV DNA检测的临床意义，HBV DNA检测的临床意义，并非所有“三阳”患者都在HBV复制机中的调查结果显示传染性；不是所有“小三阳”患者HBV都没有复制。因此，要准确确定HBV是否处于复制状态，最准确的方法是检测并确定HBV DNA。HBV DNA检测方法，斑点杂交(基本去除)定性PCR(基本去除)荧光定量PCR(主流)基因芯片(未来)？)、为什么你建议患者进行HBV DNA检查？荧

8、光定量PCR法检测HBV感染的各期。HBsAg和HBeAg是阳性还是HBV DNA阴性？干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制被抑制。PCR中所用的引物对应的DNA序列发生突变，这种引物无法与突变的DNA配对。病毒DNA整合到宿主肝细胞的染色体中，血液中很少或缺乏游离HBV DNA。乙型肝炎的治疗方法目前没有迅速消除乙型肝炎病毒的药，最好的抗病毒药疗效也只有50%左右。有正确治疗慢性乙型肝炎的效果，目前国际医疗界宣称的抗病毒药主要分为两类。干扰素：重组人-1b干扰素、- 2a、-2b干扰素等。核苷类似物：拉米夫定，阿德福韦。乙型肝炎治疗主要有抗病毒、免疫调节、抗炎、肝保护、抗纤维化等HBV DNA1

9、05的患者需要接受抗病毒治疗，拉米夫定能迅速降低HBV DNA浓度，改善肝组织病变，阻断肝纤维化过程，阻止肝硬化的发展。特别是拉米夫定不受病毒感染模式、野生型或基因组前c区突变的影响。拉米夫定还抑制肝移植受体和艾滋病患者的HBV克隆。拉米夫定治疗人口明显有HBV DNA复制者的全c区变异的慢性乙型肝炎补偿期，对慢性乙型肝炎进行肝脏移植的干扰素治疗失败的拉米夫定治疗效果，绝大多数患者HBV DNA水平明显下降。大约4周开始减少，12至16周之间约一半以上的血清HBV DNA下降到可检测的水平以下。治疗一年后HBeAg音韵约为20%。病毒反应：HBV DNA低于检测下限血清反应生化反应组织学反应，

10、应用抗病毒药后如何判断疗效？应用抗病毒药后如何判断疗效？治疗结束时完全反应1年，YMDD变异，YMDD:酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-蛋氨酸-蛋氨酸-蛋氨酸(m)变异为亮氨(I)或缬氨酸(v)，或形成YVDD变异体。，抗病毒治疗中存在的问题，HBV-YMDD变异检查的临床意义，动态检查：服用拉米夫定3个月开始每月一次早期检测：耐药临床症状发生1-4个月前，突变株及时调整：药物治疗适当调整，调整药物程序，防止因耐药引起的疾病恶化。丙型肝炎的病原体检查。丙型肝炎病毒、HCV是单链RNA病毒，主要通过血液和血液制剂感染的话，容易传染慢性肝炎或发展为肝硬化，是肝癌的全球分布，约有1%的

11、普通人口感染。抗HCV IgM和抗HCV IgG、HCV抗体不是保护抗体，而是HCV感染的标记。HCV IgM在发病后检测到，一般持续1 3个月。如果HCV IgM继续呈阳性，则病毒会继续复制，很容易变成慢性。低举重抗HCV IgG暗示病毒处于静止状态，高举重暗示病毒复制活跃。HCV抗原检测的困难，HCV在血液中含量很低，仅HBV的1% HCV病毒颗粒就很难有效分离和纯化，人工合成抗原c型肝炎的肠道很长，血清检测不能早期诊断抗体持续，不能说明正确的病毒负荷HCV类型复杂，高致突变HCV核心抗原检测工具包的灵敏度差异：HCV RNA、HCV RNA阳性是病毒感染和复制的直接标记。HCV RNA的

12、定量分析有助于理解病毒复制程度、抗病毒治疗的选择、疗效评价等。HCV RNA荧光定量PCR检测的临床意义，早期诊断：免疫学检测的“初创期”，或不产生抗体的丙型肝炎病毒携带者，可能出现HCV RNA阳性，抗HCV阴性检测结果。HCV RNA可用作HCV感染诊断的指标，以弥补ELISA方法的高泄漏率。HCV RNA定量指导药物使用，提供疗效和预后等客观指标。抗HCV不能用作抗病毒疗效的指标。慢性丙型肝炎长期呈抗HCV阳性，意味着曾感染丙型肝炎，并出现相应的免疫反应，这并不意味着体内还残留丙型肝炎的存在或克隆，这时只能通过HCV RNA定量确认丙型肝炎的活动性和克隆程度。HCV主要通过输血和血液制剂

13、传播，为减少医源性丙型肝炎的发生和传播，检查献血者和血液制剂。核酸检测HBV感染的诊断比HCV感染的诊断重要得多！性病相关病原体检查，性病在我国已成为重要的公共卫生问题。99年以来，性病发病率高的传染病中占第三位，03年我国性病患者人数(不包括HIV)73万人累计报道。浙江省是发病率高的地区，在全国排名第三。常见性病病原体，淋病双球菌(NG)衣原体(CT)人乳头瘤病毒(HPV)人类免疫缺陷病毒(HIV)，淋病双球菌的传统检测方法，涂末染色：女性患者检出率低通过荧光定量PCR分析，NG的优点在临床各种标本中快速准确地检测极低量病原体，对女性可疑淋球菌引起的各种炎症的诊断和鉴别诊断起决定性作用。症

14、状为轻度或无症状的淋球菌感染者的早期诊断和鉴别诊断，包括疗效评价、衣原体、沙眼衣原体感染和致病性，最近欧美等国家沙眼衣原体的感染率和危险性均超过了我国淋巴球菌。非淋菌性尿道炎中第一次泌尿生殖系统感染会妨碍妊娠骨盆感染，造成生殖能力损伤，传统方法检测衣原体缺陷，目前无法确定是感染还是过去感染，检测衣原体优势的荧光定量PCR，灵敏度98%以上，特异性100%提高阳性检出率适合于感染的早期诊断和无症状携带者检查。ureaplasma urealyticum、UU分离很困难，需要1-3天才能获得特殊培养基培养、运营费、初步结果。血清检查，只有10%的uu尿道炎患者在此过程中，特定抗体效价增加了4倍，方

15、法学应用受到限制。一些非致病尿素或培养中的污染会导致假阳性结果。传统方法检测解脲原体的缺陷，通过提高高灵敏度和特异性，快速、定量、准确的阳性检出率，可以为临床评价疗效提供依据，荧光定量PCR检测支原体的优点。CT，UU是美国FDA批准的PCR检测工具包，作为首选方法。只有人乳头瘤病毒、人的皮肤和粘膜上皮细胞可以感染的100多种类型。人类HPV唯一的宿主免疫原性低，持续的新生儿分娩也容易发生感染。HPV，HPV、传统巴氏杆菌的漏诊率达30%，可以在细胞学水平观察细胞的形态变化。其中80%已经被诊断为子宫颈癌晚期，检测HPV缺陷的传统方法，早期感染的病原体检查可以将HPV分类，评估病毒负荷量和癌症风险。疗效和预后是HPV感染与生殖器肿瘤的相关性研究，荧光定量PCR检测HPV的优点。人体免疫缺陷病毒、引起艾滋病的病原体、无症状和可判定为血清阴性的患者的潜在HIV传染性检查、长潜伏期的HIV携带者，在治疗期间将患者血清HIV负荷的变化缩短10天，预测病情结果，指导临床