2-酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的活性

1、血清中基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9活性的检测食管癌患者血液中基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9活性的酶谱变化及其临床意义综合设计实验2。本实验由以下三部分组成：第一部分，蛋白高级结构的预测第二部分，酶标法检测血清中基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9活性第三部分：食管癌患者血液中基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9活性的变化及其临床意义。第一部分：蛋白质高级结构的预测，蛋白质的三维构象，又称空间结构或高级结构，是指蛋白质分子中原子和基团在三维空间的排列和分布以及肽链的方向。高级结构是蛋白质表达其生物功能或活性所必需的。x射线结晶学是迄今为止研究蛋白质结构最有效的方法，其准确性

2、是任何其他方法都无法比拟的。其缺点是培养蛋白质晶体困难，晶体结构测定周期长。近年来发展起来的多维核磁共振方法可以直接测定溶液中蛋白质的构象，但由于样品需求量大，纯度要求高，测定的蛋白质分子量一般不超过20000 Da，因此也受到限制。截至2008年6月，与快速增长的巨大基因组核酸数据相反，具有已知三级结构的蛋白质数量不到60，000。(来自PDB蛋白质结构数据的统计)，基于蛋白质一级结构提供的氨基酸序列信息的高级结构预测方法是为了响应这种需要而开发的。蛋白质的一级结构决定高级结构的论点仍然是预测蛋白质三级结构的理论基础。目前，蛋白质三级结构预测的方法有：(1)基于已知结构(如晶体结构)，用分子

3、动力学方法研究蛋白质分子、核酸分子或复合物的动力学性质。(2)通过能量优化或分子动力学方法优化结构模型；或者在整体结构已知的情况下建立点突变的结构。(3)借助类似物的结构参数建立未知蛋白质的结构。(4)结合2D核磁共振数据、X射线粗结构数据或其他实验数据，建立蛋白质的整体模型结构模型。(5)当不满足上述所有条件时，根据一级结构预测二级结构，精度小于65%。(6)在已知二级结构的基础上堆积碎片，根据从已知结构中获得的一些规则进行筛选，选择可能的结构，往往得到各种可能性，但不能得到唯一正确的堆积方式。(7)当单体结构已知时，构建化合物或聚合物的结构，参考化合物或聚合物本身的性质，并使用几何匹配和最

4、大接触面积的规则。搜索蛋白质结构数据库(如PDB、瑞士-PROT等。)从待测蛋白质序列中，得到许多相似的序列(同源序列)，并选择一个(或几个)作为待测蛋白质序列的模板；将待测蛋白质序列再次与所选模板进行比较，插入各种可能的空位，以尽可能多地对齐两者的保守位置；建模：调整待测蛋白质序列中主链各原子的位置，产生与模板相同或相似的空间结构，以及待测蛋白质的空间结构模型；利用能量最小化原理，待检测蛋白质的侧链基团位于能量最小的位置。通过同源建模预测蛋白质三级结构通常包括四个步骤：SWISS-MODE蛋白质结构预测，SWISS-MODE使用同源建模来预测未知序列的三级结构。该服务创建于1993年，是自动

5、建模的先驱，也是迄今为止使用最广泛的免费服务之一。/SWISS-MODEL.html,First方法模式提供了一个简单的用户界面：用户只需要输入一个氨基酸序列，服务器就会自动选择合适的模板。如果模板和提交的目标序列之间的相似度超过25%，建模程序将自动开始运行，结果将通过电子邮件返回。，常用软件来观察蛋白质的三级结构，RasMol，WPDB，Cn3D，part ii，酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的活性，常用电泳技术，根据支持介质的不同，可分为纸电泳，醋酸纤维素电泳，琼脂凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶电

6、泳)根据支持介质的不同形状，其ROPHORIS SDS-PAGE可如下：薄层电泳板电泳柱电泳，电泳设备，垂直电泳系统， 水平电泳系统，聚丙烯酰胺凝胶电泳原理，聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(丙烯酰胺，Acr)和交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺(bis)在促进剂N，N，N，N-四甲基乙二胺(N，N，N，N-四乙基乙二胺，TEMED)和过硫酸铵(NH4)2S2O3 (AP)存在下聚合交联成具有三维网络结构的凝胶，并以此凝胶为支撑物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。N，N-亚甲基(亚甲基)双丙烯酰胺、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺和聚丙烯酰胺凝胶具有以下特点：在一定浓度下，凝胶透明、有弹性，具有良好的力

7、学性能；化学性能稳定，不与被分离物发生化学反应，不溶于多种溶剂；对酸碱度和温度变化稳定；几乎没有吸附和电渗，只要Acr纯度高，操作条件一致，样品分离重复性好；样品不易扩散，剂量小，灵敏度可达10-6g；凝胶的孔径可以调节，根据分离物质的分子量选择合适的浓度，通过改变单体和交联剂的浓度可以调节凝胶的孔径；高分辨率，特别是不连续凝胶电泳，集浓度、分子筛和电荷效应于一体。因此，它比醋酸纤维素膜电泳和琼脂糖电泳具有更高的分辨率。根据聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种具有分子筛效应的网络结构，蛋白质在电泳中保持完整，其中蛋白质是由蛋白质大小、形状和电荷三个因素分开的。然而，十二烷基硫酸钠

8、-聚丙烯酰胺凝胶电泳只根据蛋白质的分子量亚单位来分离蛋白质。这项技术最早是由夏皮罗在1967年建立的。他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基的分子量，而电荷因子可以忽略。十二烷基硫酸钠是一种阴离子洗涤剂。作为变性剂和增溶剂，它可以破坏分子内和分子间的氢键，使分子展开，并破坏蛋白质分子的二级和三级结构。然而，强还原剂如巯基乙醇和二硫苏糖醇可以破坏三联嘧啶残基之间的二硫键。在样品和凝胶中加入还原剂和十二烷基硫酸钠后，分子解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和十二烷基硫酸钠结合成蛋白质-十二烷基硫酸钠胶束，负电荷大大超过蛋白质的原始量，从而消除

9、了不同分子之间的电荷差异和结构差异。因此，在电泳过程中，蛋白质分子的迁移速度主要取决于蛋白质分子的大小。不同分子量蛋白质在凝胶中的运动图，不同聚丙烯酰胺凝胶浓度与不同分子量蛋白质混合物的分离能力之间的关系，肿瘤细胞的侵袭和运动，以及肿瘤细胞的侵袭，意味着肿瘤细胞粘附并穿过细胞外基质，包括三个重要步骤：粘附基底膜，分裂膜蛋白形成间隙，以及移动细胞穿过间隙。肿瘤细胞侵袭周围组织和血管是肿瘤细胞转移的关键步骤。转移性肿瘤细胞在主要病灶之外存活和增殖，这是癌症对人类生命的最大威胁。细胞外基质主要由胶原、糖蛋白、蛋白聚糖和氨基葡聚糖组成。细胞外基质以基底膜的形式存在于上皮细胞或内皮细胞的基部，并以细胞间

10、结构中的间质结缔组织的形式存在。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分。目前，已发现至少有12种不同类型的胶原，其中型、型和型胶原是间质结缔组织的主要成分。型胶原理主要存在于基膜中。肿瘤细胞的侵袭需要结合与细胞增殖、分化和运动相关的基因及其表达调控方式的变化，以及促进细胞运动的外部因素。虽然肿瘤细胞侵袭的分子机制尚不十分清楚，但已发现许多关键分子及其信号通路调节细胞侵袭和转移。肿瘤细胞在其表面受体粘附于细胞外基质的各种成分后，可以激活或分泌蛋白质降解酶来降解基质，从而形成局部溶解区，构成肿瘤细胞转移的操作通道。通常，恶性肿瘤细胞具有强烈的蛋白水解作用，这可以侵蚀和破坏包膜并促进转移。目前，所涉及的酶主

11、要是丝氨酸蛋白酶(如纤溶酶原激活剂)和金属蛋白酶(如胶原酶)、基质降解酶和透明质酸酶。基质金属蛋白酶家族成员根据其在细胞中的不同表达位点可分为胞质型和膜型。前者分布在细胞质中，而后者在细胞膜上表达。细胞质基质金属蛋白酶根据其底物的特异性、敏感性和氨基酸序列同源性可分为三类：(1)间质胶原酶，包括基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-8和基质金属蛋白酶-13，其底物主要是间质胶原，即、型胶原和、型胶原，但不能降解明胶和型胶原；(2)明胶酶，包括MMP-2和MMP-9，主要作用于型胶原和明胶，能降解、和型胶原，但不能降解间质胶原；(3)间充质溶解素，包括基质金属蛋白酶-3、基质金

12、属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-10和基质金属蛋白酶-11，主要作用于基质中的蛋白多糖和糖蛋白，如纤连蛋白和层粘连蛋白。间质溶素对胶原的作用不同于间质胶原酶和明胶酶，它们能降解、和，通过影响细胞外基质，基质金属蛋白酶蛋白家族参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等。并且还参与许多疾病，如炎症、肿瘤、心血管和神经疾病。基质金属蛋白酶蛋白家族，基质金属蛋白酶-2又称明胶酶A，其蛋白主要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生，分子量为72kDa。基质金属蛋白酶-9，也称为明胶酶B，主要由单核细胞、巨噬细胞、多形核白细胞和肿瘤细胞产生。分子量为92kDa，是分子量最大的酶。中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)于

13、1993年被发现，当时凯氏等研究了细胞中基质金属蛋白酶-9的存在形式。它能与基质金属蛋白酶-9聚合形成异二聚体，保护和调节基质金属蛋白酶-9的活性，从而促进恶性细胞的浸润和转移。检测基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶-2活性有助于分析肿瘤细胞的恶性程度和预后。它由310个N端螺旋、C端螺旋和中间8个反平行折叠组成，形成折叠桶形结构。折叠筒结构的一端是开放的，这提供了与配体结合的入口；而另一端由短的n端310螺旋封闭。疏水的芳香族和脂肪族氨基酸残基排列在折叠桶的底部，形成疏水的核心或疏水的内部，为亲脂性配体提供结合位点。NGAL的三级结构，基质金属蛋白酶-2的结构，前：信号肽序列前肽与巯基锌离子

14、结合部分能结合胶原蛋白的第二型纤连蛋白结构域H:铰链区血红素：血红素样蛋白结构，由四个重复序列组成，其中第一个和第四个之间有一个二硫键。基质金属蛋白酶-9的结构由三个螺旋和五个折叠组成，其中含有两个锌离子和五个钙离子。从右图可以看出，一种小分子化合物位于酶的活性中心，并与一个锌离子结合。NGAL可以二硫键的形式与基质金属蛋白酶-9结合，从而保护和调节基质金属蛋白酶-9的功能。因此，NGAL与肿瘤的侵袭和运动密切相关。汕头大学医学院生物化学与分子生物学系的李恩民教授以转染pcDNA3空白质粒载体的SHEEC细胞为对照。酶谱结果显示，转染pcDNA-NGAL (-)的SHEEC细胞分泌的基质金属蛋

15、白酶-9和基质金属蛋白酶-2活性显著降低。同时，转染NGAL阳性细胞后分泌的基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶-2活性显著增加。这表明NGAL基因的表达通过有义和反义技术发生了改变，从而显著影响SHEEC细胞分泌的基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶-2的活性。m:蛋白质标记；1.细胞培养基；2.pcDNA33.pcDNA-NGAL()；前列腺癌相关基因ngal (-)、基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的活性与肿瘤的侵袭和转移能力密切相关。明胶是这两种酶的底物。因此，体外酶谱法检测标本(组织、细胞培养基、血清、血浆和尿液)中基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的活性，对了解肿瘤细胞的恶性

16、程度、监测疗效和评估预后具有重要的指导意义。酶谱法的基本过程是用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(含0.1%明胶)分离样品，然后用二价金属离子在缓冲体系中恢复样品中基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的活性，水解凝胶中明胶的各自迁移位置，最后用考马斯亮蓝对凝胶进行染色，然后脱色。在蓝色背景下，可以出现白色的条带，条带的强度和基质金属蛋白酶-1。实验原理实验操作样品制备：血清、血浆和尿液样品可直接与等体积的2SDS样品缓冲液混合进行下一次实验，如果酶活性过高而导致显带不满意，可适当稀释；凝胶制备：将：块玻璃板对齐，然后放入夹子中进行垂直夹紧。根据表格，准备10%分离胶，加入TEMED后立即摇动。灌胶时，用5ml取样枪吸取凝胶，沿玻璃板加入，然后在胶上加一层异丙醇，隔绝空气中的氧气，促进凝胶聚合(灌胶时启动较快，当胶面接近要求高度时减慢。在操作过程中，凝胶必须向下流到玻璃板，这样凝胶中就不会有气泡。几分钟后，当异丙醇和胶水之间有折射线时，这意味着胶水已经凝固。等待3分钟使胶水完全固化后，可以倒出胶水顶层的水，用吸水纸将水吸干。按照上表准备4%浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀。用浓缩胶水填充剩余空间，然后将梳子插入浓缩胶水中。倒胶时，让胶水顺着玻璃板流下，以避免胶水中出现气泡。插入时保持梳子水平。浓缩胶凝固后，用双手握住梳子的两