硝酸还原酶活性的测定

1、硝酸还原酶活性的测定,一、目的,硝酸还原酶（NR）是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。 通过本实验可以初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理和方法。,离体法需将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。由于研磨中NADH受损失，必需外加NADH方可测定。 活体法直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO3-进入细胞后，被硝酸还原酶还原成NO2-并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中NO2-的含量即可得知硝酸还原酶活

2、性的大小。,活体法不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不断生成，无需外加。活体法简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条件，但重复性欠佳，应作一定量的重复。 本实验采用活体法测定硝酸还原酶活性。,二、原理,硝酸还原酶可将NO3-还原成NO2-： NO3-+NADH+H+ NR NO2- +NAD + +H2O 在一定条件下，NO2-的生成量与硝酸还原酶活性呈正相关。NO2-含量可用磺胺显色法测定，即在酸性条件下与对-氨基苯磺酸胺发生重氮反应，生成的重氮化合物又与N-萘基乙二胺盐酸盐（或-萘胺）生成红色偶氮化合物，可在520nm下比色测定。,植物 对-氨基苯磺酸胺 NO3- NO2-

3、重氮化合物 -萘胺 比色 红色偶氮化合物 520nm,三、实验材料、仪器,1材料 小油菜 2仪器 （1）天平 （2）注射器 （3）试管 （4）50mL三角瓶3 （5）恒温箱 （6）分光光度计,四、试剂,1.亚硝酸钠标准溶液5g/mL NaNO2 0.1g定容至100mL，取其中2.5mL稀释定容至500mL，即为5g/mL浓度的NaNO2标准液 2.硝酸钾标准溶液0.2mol/L KNO3 2.02g用磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，即为0.2mol/L的KNO3标准液,3.1%对氨基苯磺酸 对氨基苯磺酸1g，加浓盐酸25mL，用蒸馏水定容至100mL；共配制2次，200mL 4.0.2%-

4、萘胺 -萘胺0.2g，加冰乙酸25mL，用蒸馏水定容至100mL；共配制2次，200mL 5.30%三氯乙酸 三氯乙酸30g，用蒸馏水定容至100mL,五、操作步骤,1酶反应和酶活性的测定 将实验材料使用打孔器打成圆片，混合均匀后分别称取2份，每份1g左右，编号后按表2加入各种试剂： 三角瓶号 1 2 0.2mmol/L磷酸缓冲液（mL） 4.0 4.0 0.2mmol/LKNO3溶液（mL） 5.0 5.0 30%三氯乙酸（mL） 1.0 0,+,在针筒中进行反复抽气，直到放气后叶片变软并沉入溶液；将针筒中混合溶液和叶片取出放入编号三角瓶中，在30、暗条件下保温30min；取出后立即向2号瓶

5、加入1mL 30%三氯乙酸以终止酶反应。,然后分别吸取上清液1mL于另一试管中，各加入2mL 1%对氨基苯磺酸和2mL 0.2% -萘胺（注意顺序），室温显色30min后测定520nm波长下的光密度 用2号管溶液光密度平均值减去1号管溶液的光密度，得到的值在标准曲线上查出相应的NaNO2含量（g）,2标准曲线的制作 取6支干净试管，编号，按表1加入试剂：摇匀后在室温下放置30min，然后在520nm波长下测定光密度，以亚硝酸含量和光密度值绘制标准曲线 (按顺序加试剂),取样 称量、编号 加缓冲溶液 暗处保温 抽气 测吸光光度值 显色反应 取1mL 计算含量 绘制亚硝酸钠 标准曲线,六、结果与计算,把在标准曲线上查得的NaNO2含量代入下式，计算硝酸还原酶活性： NaNO2含量(g) 稀释倍数 NR活性NaNO2(g)/鲜重(g)h=