常用分子生物学技术的原理及其应用.ppt

1、一，1，生物化学和分子生物学，一，2，分子生物学中常用技术的原理和应用，第20章，一，3，1节，分子杂交和印迹技术，一，4，核酸杂交在脱氧核糖核酸复性过程中，如果不同的脱氧核糖核酸单链分子被放在同一溶液中，或者脱氧核糖核酸和核糖核酸被放在一起，只要脱氧核糖核酸单链分子或核糖核酸单链分子之间存在一定的碱基配对关系，不同分子之间就可以形成杂交双链体。第一，分子杂交和印迹技术的原理，a，5，a，6，(1)印迹技术，它利用各种物理方法将电泳凝胶中的生物大分子转移到各种膜上，如NC，并使它们变成固体分子。这种技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨水，所以被称为“吸墨法”，也就是吸墨法。a，7。末端或全链用已知

2、序列的放射性核素、生物素或荧光染料标记的多核苷酸链称为“探针”，它能与固定在细胞膜上的核苷酸结合，判断是否存在同源核酸分子。(2)探针技术，a的种类和应用，8，2，印迹技术，(1)南方印迹，(2)北方印迹，(3)西方印迹，用于基因组DNA，重组质粒和噬菌体的分析。用于核糖核酸的定性和定量分析。用于蛋白质及其相互作用的定性和定量分析。a，9，其他：斑点印迹，原位杂交)DNA芯片，a，10，三种印迹技术的比较，分子杂交实验，a，12，放射自显影，a，13，DNA芯片技术，a，14，第2节，聚合酶链反应技术的原理和应用，a，15，5，引物1，5，引物2，5，5，模板DNA，1。聚合酶链反应技术的工作

3、原理，a，16，a，17，聚合酶链反应技术的示意图，a，18，聚合酶链反应的基本反应步骤，变性95，延伸72，退火TM-5c，a，19，模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dntpsm2，聚合酶链反应系统的基本组成，a，20，利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有相似序列的基因片段；用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。第二，聚合酶链反应技术的主要用途，(1)目的基因的克隆，一，21，聚合酶链反应技术可以用来随意设计引物，在体外修饰目的基因片段，如插入，缺失和点突变。聚合酶链反应技术灵敏度高，对模板DNA的量要求低，是DNA和RNA微量分析的最佳方法。(3)脱氧核糖核酸和核

4、糖核酸的微量分析，(2)基因突变，a，22。将聚合酶链反应技术引入到DNA序列测定中，大大简化了测序工作，提高了测序速度；待检测的DNA片段可以被克隆到特定的载体中用于序列测定，或者可以被直接测定。聚合酶链反应和其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的灵敏度。(4)脱氧核糖核酸序列测定，(5)基因突变分析，一，23，逆转录聚合酶链反应(逆转录聚合酶链反应)是一种结合了核糖核酸逆转录反应和聚合酶链反应的技术。目前，逆转录-聚合酶链反应是从组织或细胞中获得靶基因以及用已知序列对核糖核酸进行定性和半定量分析的最有效的方法。(1)逆转录聚合酶链式反应技术，(3)几种重要的聚合酶链式反应衍生技术，a，2

5、4，原位聚合酶链式反应(原位聚合酶链式反应)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞中进行的聚合酶链式反应，然后用特异性探针进行原位杂交以检测待检测的DNA或RNA是否存在于组织或细胞中。原位聚合酶链反应弥补了聚合酶链反应和原位杂交的不足，是结合靶基因扩增和定位的最佳方法。(2)原位聚合酶链反应技术，(2)实时聚合酶链反应技术，(3)实时聚合酶链反应技术通过动态监测反应过程中产物的数量，消除了产物积累对定量分析的干扰，也称为定量聚合酶链反应。，A，26，实时聚合酶链反应技术原理，A，27，实时聚合酶链反应的分类，A，28，图20-3用TaqMan探针法进行实时聚合酶链反应的示意图，A，29，第3节，

6、基因文库，A，30，基因组DNA文库，基因文库(gene library)，A，31，1。基因组DNA文库，指生物基因组DNA(包括所有编码区和非编码区)的信息以DNA片段的形式储存在其中的克隆群体。用于构建基因组文库的载体包括噬菌体、粘粒和酵母人工染色体。a，32，基因组文库和cDNA文库的构建和筛选，a，33，第一次筛选，第二次筛选，第三次筛选，基因组文库筛选结果的实例，a，34，cDNA文库是一个克隆群体，其包含在一定条件下由一定组织细胞表达的所有mRNA的逆转录合成的cDNA序列，其以cDNA片段的形式存储组织细胞的基因表达信息。第二，cDNA文库，a，35，第4节，生物芯片技术，a，

7、36，是指许多特定的DNA片段规则紧密排列并固定在每单位面积的支持物上，然后与待检测的荧光标记样品杂交，杂交后，用荧光检测系统扫描芯片等。通过计算机系统检测、比较和分析各个位点的荧光信号，可以快速获得定性和定量结果。这项技术也被称为基因微阵列。1.基因芯片，基因芯片，a，37，基因芯片工作流程示意图，a，38，是将高度密集排列的蛋白质分子作为探针点阵固定在固体支持物上，与待测蛋白质样品反应时捕获样品中的目标蛋白质，然后通过检测系统对目标蛋白质进行定性和定量分析的技术。二、蛋白质芯片，蛋白质分子间的亲和反应，蛋白质芯片，蛋白质芯片作用原理，a，39，第5节，蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用

8、研究的方法，a，40，1。蛋白质相互作用研究技术、酵母双杂交亲和分析(标签蛋白沉淀、免疫沉淀等。)荧光共振能量转换效应分析噬菌体展示系统筛选，常用的蛋白质相互作用研究技术，a，41，tag融合蛋白结合实验是一种基于亲和层析原理分析蛋白质体外直接相互作用的方法。(1)标签蛋白沉淀，标签融合蛋白结合实验主要用于证明两个蛋白分子之间是否存在直接的物理结合，分析两个分子之间结合的具体结构位置，筛选细胞中与融合蛋白结合的未知分子。a，42，标签融合蛋白沉淀实验流程示意图，a，43，(2)酵母双杂交技术的基本原理及应用，a，44，酵母双杂交系统的应用，生物信息学推测两种具有已知基因序列的蛋白可以相互作用。分析已知相互作用的两种蛋白质分子的相互作用功能域或关键氨基酸残基。通过将待研究蛋白的编码基因与BD基因融合到“诱饵”表达质粒中，可以筛选与AD基因融合的“猎物”基因的表达文库，并筛选未知的相互作用蛋白。a，45，电泳迁移率偏移分析(EMSA)或凝胶偏移分析最初用于研究DNA结合蛋白和相应的DNA序列之间的相互作用，可用于定性和定量分析，并已成为转录因子研究的经典方法。目前，这项技术也用于研究核糖核酸结合蛋白和特定核糖