基因表达分析技术.ppt

1、a，1。基因表达分析方法，a，2、基因、mRNA、蛋白质多肽链、基因表达，a，3，1。通过检测基因转录水平的表达特征。根据分析方法的原理和功能特点，基因表达分析可分为：个封闭系统的研究方法。33333333335开放系统研究方法：如差异显示聚合酶链反应、双向基因表达指纹图谱、分子指数法、随机引物聚合酶链反应指纹分析等，可以发现和分析未知基因。本文主要介绍已知基因的常用表达分析方法。(1)基于杂交原理的信使核糖核酸表达水平的检测，1正杂交是一种基于核糖核酸-脱氧核糖核酸杂交原理的核糖核酸分析技术，这意味着核糖核酸通过电泳变性和分离，然后转移到固体支持物上，通过杂交反应鉴定特定信使核糖核酸分子的含

2、量和大小。a，5，三种印迹技术的比较，a，6，核糖核酸琼脂糖凝胶电泳，northern印迹杂交，a，7，分子杂交实验，a，8，放射自显影照片，目录，a，9，2核糖核酸无菌保护试验，RPA)是一种具有高灵敏度和特异性的定量分析方法。基本原理是将标记的特异性核糖核酸探针(32P或生物素)与待检测的核糖核酸样品在液相中杂交，标记的特异性核糖核酸探针与目标核糖核酸结合形成双链核糖核酸，该双链核糖核酸不经核糖核酸酶消化。而未结合的单链核糖核酸被核糖核酸酶a或核糖核酸酶T1消化形成寡核糖核酸。a，10，RPA基本程序：用体外转录标记的核糖核酸探针分离待测核糖核酸，待测核糖核酸与探针核糖核酸的液相杂交，核糖

3、核酸酶消化，不同大小杂交片段的凝胶电泳分离，a，11，核糖核酸酶保护实验原理示意图，32P标记探针：杂交双链变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用放射自显影或磷筛选成像系统检测探针信号；生物素标记的探针：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，杂交的双链被电转移到尼龙膜上，链霉亲和素辣根过氧化物酶和化学发光底物与膜上的生物素标记的探针结合，杂交信号由x光片或化学发光图像分析仪检测。a，12，RPA相对于NorthernBlot印迹的优点如下：1 .过量探针与靶基因的杂交在液相环境中完成，反应更加完全；2.RPA比NorthernBlot印迹的灵敏度高15，150倍，适用于检测不同表达水平的基因；3.RPA具有高通量，可

4、以同时检测多个基因。在相同的情况下，可以评估它们的差异表达。4.RPA一次可以完成10个以上的NorthernBlot，加快了研究速度。a，13。在细胞或组织中原位表达的信使核糖核酸可以被定位，并且标记的探针可以与靶信使核糖核酸序列特异性杂交，并且可以检测标记的信号以确定基因在组织和细胞中表达的位置信息。它可以作为定量分析的补充。原位杂交技术的主要步骤：材料处理和细胞样品固定；样品制备和预处理；探针的制备和预杂交；探针和样品的变性；杂交孵化；检测杂交信号并分析结果。一，15，(2)逆转录-聚合酶链反应，一种常用的方法为基因检测，1逆转录聚合酶链反应可用于基因的半定量分析。反转录-聚合酶链反应(

5、逆转录-聚合酶链反应)是以核糖核酸为模板，在体外扩增核糖核酸，然后以核糖核酸为模板，对特定的基因转录物进行聚合酶链反应扩增。逆转录聚合酶链反应技术通常用于核糖核酸的定性分析。如果设置了阳性参考，可以对待测的核糖核酸样品进行半定量分析。逆转录实时定量聚合酶链反应，一，16、逆转录酶、聚合酶、基因表达产物、基因表达产物、杂交双链、聚合酶扩增、一，17、聚合酶链反应技术原理，一，18、5、引物1、5、引物2、5、5、5、目录，一，20、模板特异性引物耐热的聚合酶脱氧核糖核酸聚合酶脱氧核糖核酸二聚体，聚合酶链反应系统的基本组成，一，21、聚合酶链反应的基本反应步骤，变性95C、延伸72C、退火Tm-5

6、C、一，221、控制(无模板)；26.聚合酶链反应产物(5ul样品)，A，27，凝胶成像系统，A，28，目标扩增，无扩增子循环数，目标122438416532664201，048，576301，073，741，824，等等，2个循环=4个扩增子，3个循环=8个扩增子，4个循环=16个扩增子，5个循环=32个扩增子，6个循环=64个扩增子，7个循环=16个扩增子常规聚合酶链反应方法的局限性分析：无法准确定量初始模板，只能分析最终产物，扩增后必须进行电泳分析，费时费力，EB有毒，不能实时检测扩增反应。A，30，2，实时荧光聚合酶链反应，A，31，非特异性荧光染料，Sybrgreenisyboldd

7、ethidiumbromide，A，32，延伸，延伸，连续交换波长，重复，dnabindingdies，A，33，实时荧光聚合酶链反应技术原理，目录，A，34，非特异性嵌入荧光染料评价，优点：与特异性荧光探针相比，它更便宜，只需要设计聚合酶链反应引物。缺点：由于其与模板的结合是非特异性的，因此它可以与包括引物和非特异性扩增产物在内的所有双链DNA结合，不能真实反映靶基因的扩增情况。a，35，TaqMan探针评价，优点：与其他探针相比荧光信号强，设计简单，可用于多通道检测，也可用于SNP检测。缺点：价格比DNA结合染料高，a，36，CT value和实时定量聚合酶链反应理论，CT值(阈值循环)，

8、当扩增产物的荧光信号在聚合酶链反应扩增期间超过基线值(进入指数生长期)时的循环数。a，37，初始模板浓度越高，Ct值越小。初始模板拷贝数的对数与Ct值和初始模板浓度之间存在线性关系。如果模板浓度加倍，Ct值将提前一个周期到达。如果模板浓度加倍，Ct值将在一个周期后到达。a、38、绝对定量可以得到样本中基因的拷贝数和浓度。标准曲线可以通过使用具有已知初始拷贝数的标准来制作。因此，只要获得未知样品的Ct值，就可以从标准曲线计算出样品的初始拷贝数。a，39，a，40，3，原位聚合酶链反应技术，a，41，原位聚合酶链反应(ispcr)是由Haase等人于1990年发起的。它使用整个细胞作为一个微小的反

9、应系统来扩增细胞中的靶片段，并使用一些特定的检测方法来检测细胞中的扩增产物而不破坏细胞。用细胞涂片或石蜡包埋的组织切片直接在单细胞中进行扩增。可以进行细胞内定位。适用于检测病理切片、A、42、16个载玻片和0.2毫升试管块、A、43、A、44的24个样品中含量较少的靶序列。操作步骤1。细胞或组织固定：在固定和乙醇渗透后，细胞适用于一般的聚合酶链反应试剂(包括引物和Taq酶)。2.细胞内靶片段的聚合酶链反应扩增。扩增产物的原位杂交检测。阴性对照，原位检测基因表达，45，基因芯片(cDNAchip)是指许多特定的基因片段或基因片段作为探针，它们规则地紧密排列并固定在每单位面积的支持物上。4。通过基

10、因芯片分析基因表达谱(基因表达的高通量分析)，基因芯片，A，46、目录，A，47，2。蛋白质检测揭示基因翻译水平的表达特征，Westernblot是一种免疫印迹技术，其基本原理类似于核酸杂交，仅使用与标记物偶联的抗体分子作为探针。当在蛋白质水平上检测特定基因的表达活性时，最常见的方法是使用蛋白质印迹来定性和半定量地分析细胞或组织的总蛋白质中的特定蛋白质。(1)基因编码的多肽可通过特异性抗体的蛋白质印迹直接测定，a，48，蛋白样品的制备SDS-PAGE分离蛋白转移膜特异性抗体(即第一种抗体)通过印迹与膜上的蛋白(抗原)杂交，然后第二种抗体(即抗-抗体，其与可检测的标记信号偶联，与辣根过氧化物酶偶

11、联的ig主要用于商业试剂盒中，最后通过与酶的底物反应进行开发和成像。扫描后，获得蛋白质印迹信息，蛋白质印迹的基本步骤，A，49，A，50，A，51，A，52，蛋白质印迹，A，53。待测样品固体载体表面的抗原或抗体与特异性抗体(一级抗体)-酶联二级抗体(也可预先包被抗体)反应结合，反应后，用专用微量板阅读器测量并记录数据。(2)酶联免疫吸附试验，a，54，特征：1。特异性；2.高灵敏度；3.稳定，操作简单，样品用量少，适合大规模筛选，尤其适合检测体液中的微量特异性抗体或抗原；4.定性测试和定量分析都可以。酶联免疫吸附试验，a，55，免疫组织化学是一种通过抗原-抗体反应和颜色反应使用标记的特异性抗

12、体原位检测组织或细胞中的特异性抗原(即靶蛋白)的方法，简称免疫组织化学实验。近年来，由于荧光标记抗体的广泛应用，这两种方法统称为免疫荧光。(3)原位检测组织/细胞中表达的蛋白质的免疫组化试验，A，56，A，57，人皮肤角质细胞的免疫荧光染色，A，58，(免疫荧光)，靶分子的定性、定量和定位分析可通过荧光(倒置)显微镜或共聚焦显微镜、激光共聚焦显微镜进行。其中，抗体对蛋白质靶的特异性、种间交叉反应、检测系统的灵敏度和细胞或组织的固定类型是该方法的关键因素。通过双重染色或多重染色程序同时检测多个感兴趣的靶分子，是揭示更多关于细胞群功能及其相互作用的信息的有效方法。免疫组织化学主要用作定性和定位技术

13、，如果与密度测量系统和图像分析系统等测量工具相结合，也可以获得定量数据。流式细胞术在细胞水平分析特定蛋白质的基本原理也是抗原抗体反应，它利用荧光标记抗体与抗原的特异性结合，通过流式细胞术分析荧光信号，从而根据表达特定蛋白质的细胞水平来判断某些蛋白阳性细胞(即表达特定基因的细胞)。(4)流式细胞术用于分析细胞特异性表达的蛋白质。a，60。流式细胞术可以检测活细胞和固定有甲醛的细胞。它广泛用于细胞表面和细胞上分子表达水平的定量分析，并能根据各种蛋白质的表达模式区分细胞亚群。此外，流式细胞术可以利用多种荧光标记抗体同时标记和监测多种基因产物，是细胞快速分析、分选和特征鉴定的有效方法。a，61，它是将

14、具有高亲和力特异性的探针分子(如单克隆抗体)固定在底物上，以鉴定复杂生物样品溶液中的靶多肽；蛋白质功能芯片可用于研究蛋白质修饰、蛋白质-蛋白质/脱氧核糖核酸-蛋白质/核糖核酸-蛋白质，以及蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、小分子-蛋白质等的相互作用。(5)蛋白质表达谱的蛋白质芯片分析(基因表达的高通量分析)，蛋白质芯片，A，62，蛋白质检测芯片包括：抗体芯片，抗原芯片，配体芯片等。a，63。目前，二维电泳(二维电泳)结合质谱被广泛用于比较和鉴定蛋白质表达谱。原理：根据蛋白质分子的等电点和分子量来分离蛋白质混合物。电泳结果染色后，可以比较不同样品中蛋白质的表达谱。也可以从凝胶中切下特定的蛋白

15、质，用胰蛋白酶消化以获得短肽片段，并用质谱技术定性分析以鉴定差异表达的蛋白质。数百种蛋白质可以同时分离。(6)双向电泳结合质谱广泛用于蛋白质表达谱的分析和鉴定。二维凝胶电泳，2DE技术组成：第一阶段：IEF采用由丙烯酰胺和不同ph值的两性电介质形成的固定PH梯度IEF-聚丙烯酰胺凝胶电泳；第二阶段：分子筛凝胶电泳特征：1 .细胞中几乎所有的蛋白质都同时被分离(以斑点的形式)；2.在高灵敏度和高分辨率银染条件下，可达到10-1510-18摩尔的水平。3.便于计算机分析和处理电泳分离图。扫描输入计算机后，可以比较不同条件下蛋白质定位、等电点和分子量定量的图谱，建立蛋白质组数据库。a，65，a，66，a，67，a，68，a，69，蛋白质组学研究中常用的质谱仪注入系统离子源质谱仪离子质谱仪，电喷雾质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF)，a，71，质谱在蛋白质组学研究中的作用，1。肽质谱和肽序列分析。翻译后筛选后的蛋白质鉴定，N-末端封闭，磷酸化，糖基化3。其他：蛋白质二硫链的定量和定位分析蛋白质-蛋白质相互作用分析蛋白质相互作用的其他分子分析蛋白质二级结构比较不同的条件(正常细胞和异常细胞，从不同的发育阶段获得单一有价