基因扩增技术.ppt

1、聚合酶链式反应(聚合酶链反应)，也称为无细胞分子克隆系统或体外特异性DNA序列引物导向的酶促扩增方法，是在模板DNA、引物(模板两端的已知序列)和四个脱氧核苷酸存在下的一种依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。聚合酶链反应技术是由塞特斯公司和加州大学于1985年共同创造的。主要贡献者是卡里穆利斯、赫内亚和埃尔里奇。非常少量的目标DNA可以被特异性扩增数百万次，并且每100，000个细胞中仅含有一个目标DNA分子的样品可以被检测到。因此，发明家卡yB和mulis获得了1993年的诺贝尔化学奖。1993年获得诺贝尔化学奖，聚合酶链反应的类型，重复实验：为了防止各种原因造成的实验误差，应进行重复验证，以

2、确保实验结果的重复性。污染处理和酸处理：用1M稀盐酸擦拭或浸泡被污染的设备，可促进脱氧核糖核酸的脱嘌呤；紫外线灯照射：紫外线波长一般为254/300纳米，照射时间为30分钟。紫外线照射可以促进DNA形成二聚体，防止链延伸。紫外线照射对长的DNA片段有效，但对短的DNA片段无效。巢式聚合酶链反应，对于非常少量的靶序列，很难在一次扩增中获得令人满意的结果，因此巢式聚合酶链反应可以用于多次扩增。引物之间的关系如下图所示：引物1和引物4是第一次扩增，它们的产物用作模板，而引物2和3用作再聚合酶链反应的引物。如果第一个聚合酶链反应产物在凝胶上有可见条带，第二个聚合酶链反应只能使用第一个聚合酶链反应产物的

3、1/104-105作为模板。实时聚合酶链反应和实时聚合酶链反应是1996年以来发展起来的新技术。1.荧光定量聚合酶链反应技术的整个操作过程是在完全封闭的状态下进行的，有效避免了“假阳性”实验结果。2.荧光探针的使用提高了检测的灵敏度和特异性，并能准确定量样品的模板数量。3.经聚合酶链反应扩增后，样品模板的数量可直接定量，无需电泳等后处理，具有分析时间短、重复性好、省力、成本低等优点。TaqMan探针和ATaqMan探针同时携带荧光报告分子和淬灭剂，没有荧光信号出现；在退火阶段，引物和探针同时与模板结合；c在延伸阶段，标记酶水解探针，并切割报告分子，从而释放荧光信号，荧光信号的强度与模板的量成比

4、例。用荧光染料掺入法，一些染料能特异性地结合双链DNA，但不能结合单链DNA，染料结合双链DNA后发光强度明显增加。检测与双链DNA结合的荧光染料发出的荧光可以实时监测PCR扩增产物的数量。SYBRGreenI是一种荧光染料，它能与DNA双螺旋的小凹槽结合。最大吸收波长约为497纳米，最大发射波长约为520纳米。优点：1。由于它与所有双链DNA结合，由于模板不同，所以没有特别定制，通用性好，价格相对低廉。2.因为一个聚合酶链反应产物可以与多分子染料结合，所以它的灵敏度非常高。缺点：1。因为SYBRGreenI与所有双链DNA结合，引物二聚体、单链二级结构和非特异性扩增产物会导致假阳性。因此，分

5、析仅限于特定的扩增产物；(可通过溶解曲线分析产品的特异性)染料可影响扩增效率。实时定量聚合酶链反应的Ct值概念，是实时定量聚合酶链反应技术中一个重要的定量参数。阈值是明显大于背景信号的荧光信号值。它总是出现在指数放大期。达到荧光阈值所需的最小周期数是Ct值。在反应开始时，模板越多，达到荧光信号阈值所需的周期越少。实时定量聚合酶链反应(SYBRGreenI掺入法)检测前列腺基质细胞中GAPDH和TGFb1表达的荧光曲线，实时定量聚合酶链反应检测前列腺基质细胞中GAPDH和TGFb1表达的解链曲线(单峰表明产物是单一的，没有特异性扩增)，实时定量聚合酶链反应检测前列腺基质细胞中TGFb1的表达。CT=靶基因CT值-内参照基因Ct值=实验组样本Ct值-对照组样本Ct值，42，实时定量聚合酶链反应检测前列腺基质细胞中转化生长因子1表达直方图，TaqMan探针检测的前列腺特异性抗原质粒荧光曲线(107拷贝至103拷贝)，44，TaqMan探针检测前列腺特异性抗原质粒获得的标准曲线Y=-0，23x11，Ct值R2=0，993(y为模板的对数，X为Ct)，45。采用实时荧光定量聚合酶链反应(Taq