第七章 酶的定向进化和稳定性探究

1、EnzymeEngineering酶工程,第七章酶的定向进化与稳定性探究,第一节定向进化简介第二节定向进化的应用第三节蛋白质的稳定性第四节蛋白质不可逆失活的原理和机理,第一节定向进化简介,一理论来源二概念三定向进化的选择策略四杂合酶,一理论来源,利用基因工程原理可以在实验室中模拟生物进化过程化学进化生物进化,二概念,酶分子改造化学修饰，定点突变定向进化,定向进化示意图,随机突变+定向选择目标突变体,Strategiesforthedevelopmentofeffectiveenzymes,定向进化,属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自

2、然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。,澄清一个事实：定向进化不是定点突变,定向进化：突变筛选突变位点是随机的，不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变的效应更是不可预知的；理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。定点突变：突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。,三定向进化的选择策略,关键突变和筛选突变采用回交法筛选蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和X光片消化分析,DNAshuffling,体

3、外定向进化,成功实例,Lipasegenes(lipB52,lipB68)isolatedfromPseudomonasfluorescensB52、B68GenbankAccssionnumberAY623009、AY694785,成功实例Lipasegene(lipB52）expressedinPichiapastorisKM71,ZhengbingJiang,Yitaozheng,YuLuo,GangWang,HongpingWang,YushuMaandDongzhiWei*.CloningandExpressionofaNovelLipaseGeneFromPseudomonasfl

4、uorescensB52.MolecularBiotechnology.2005(31),095-102.,SDS-PAGEanalysisoflipaseonexpressionandpurification,functionallipasesecretedbyRecombinantsscreenedwithBMMYplates,EnantioselectiveesterificationofR-phenylethanol,S-phenylethnolremainedatitsoriginalformeep98.7%andconversion48.1%at40oCfor48hours.,Mo

5、delChiralReactionCatalyzedbyLipaseB52,Transesterificationbetweensoybeanoilandmethanol.Conversion90%at40oCfor35hours,ProductionofBiodieselviaTransesterificationCatalyzedbyLipaseB52,CharacterizationofapsychrophiliclipasefromPseudomonasfluorescensstrainB68,p-nitrophenylcaprateassubstrate.Optimaltempera

6、tureas20C，50%activityat0C。,HydrolyzationactivityoflipaselipB68,ChiralselectivityoflipB68,ModelReaction：Chiralresolutionof-phenylethanoland-phenylpropanolviaesterification.,Reactionsystemcontained:0.5mmolofracemic-phenylethanolor-phenylpropanoldissolvedin10mltoluenecontaining1mmolofvinylacetate,with0

7、.5gimmobilizedenzymeadded.Samplestakenat120hourandsubjectedtoGCanalysis.,ProductionofBiodieselviaTransesterificationCatalyzedbyLipaseB68,Yieldto92%at20Cand24hourswithimmobilizedlipB68.Thelowesttemperaturereportedpreviously.,ProductionofbiodieselfromsoybeanoilbyimmobilizedlipB68,LipaseR&Dfromuncultur

8、edmicroorganismLipasegenes(lipJ02,lipJ03)isolatedfromenvironmentalsample,ClonedwithGenome-Walking.GenbankAccssionnumberAY673674、AY700013,LipaseR&DfromunculturedmicroorganismLipasegenes(lipJ02,lipJ03)expressedinPichiapastorisKM71,ZhengbingJiang,DongzhiWei*etal.,AppliedMicrobiologyandBiotechnology,200

9、6,OnlineFirst.,FunctionallipasesecretedbyRecombinantsscreenedwithBMMYplates,SDS-PAGEanalysisoflipaseonexpressionandpurified,Prodrugsofibuprofen,Synthesisofibuprofenglucopyransidederivative,(a)methyl-D-glucopyranoside,(b)ibuprofen,(c)6-O-(2R-(4-isobutylphenyl)propionyl)-D-glucopyranoside(d)6-O-(2S-(4

10、-isobutylphenyl)propionyl)-D-glucopyranoside,Xiang-GuoZhao,Dong-ZhiWei*,AfacileenzymaticprocessforthepreparationofibuprofenesterprodruginorganicmediaJ.MolecularCatalysisB:Enzymatic,2005,36:47-53.,DongzhiWei*,PingZou,J.MolecularCatalysisB:Enzymatic,2002,18:273-278.,BiosynthesisofEthylglucosideLactate

11、,WeiDongzhi*,Yuying,BiocatalysisandBiotransformation,2003,21(3)135-139.,EnzymaticSynthesisofEthyl-glucosideMonooleatewithLipaseinSolvent-freeMedium,QingxunSong,DongzhiWei*,J.MolecularCatalysisB:Enzymatic,2002,18:261-266.Qing-XunSong,Dong-ZhiWei*,etal.,BiotechnologyLetters,2004,26(23):1777-1780.Qingx

12、unSong,DongzhiWei*,etal.,BioprocessandBiosystemsEngineering,2006,Onlinefirst.,StudiesofVitaminestersynthesisbyimmobilizedlipasefromCandidasp.,四杂合酶,来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶分子进行组合或交换，以产生具有所需性质的优化酶杂合体。,第一节结束,点击返回,第二节定向进化的应用,一提高酶分子的催化活力二提高酶分子的稳定性三提高底物的专一性和增加对新底物催化活力的进化五对映体选择性的定向进化六变换催化反应专一性,一提高酶分子的催化活力,L天冬氨酸酶

13、定向进化研究进行4轮易错PCR，筛选了3000个菌落。得到酶活力提高28倍的突变体，该酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶,二提高酶分子的稳定性,T4溶菌酶11个不同的单点突变株将Tm提高0.8-1.4.8株大肠杆菌核酸酶HI单点突变中，7株Tm提高了0.7-4.2,三提高底物的专一性和增加对新底物催化活力的进化,Gulick分离到了一株谷胱苷肽转硫酶，对于癌症治疗中烷化剂的耐受力提高了9倍Widersten利用噬菌体呈现技术来增加谷胱苷肽转移酶与亲电底物结合力，没有成功,四对映体选择性的定向进化,S型选择性的转氨酶转化-丁酮，仅有65%的手性专一性。通过10000个随机突变的菌株的筛选，获得10个手性专一性在80%-94%之间的酶,五变换催化反应专一性,来源于铜绿假单胞菌的脂肪酶对于底物p-硝基-苯基-2-甲基葵酸盐的S构型的选择性2%。经过4轮易错PCR突变和筛选后，它对底物的S型的选择性达到81%,第二节结束,点击返回,第三节蛋白质的稳定性,蛋白质稳定性的分子原因测定蛋白质稳定性的方法,蛋白质稳定性的分子原因,金属离子、底物、辅因子和其他相对分子质量配体的结合作用蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用盐桥和氢键二硫键图一图二对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低氨基酸残基的坚实装配疏水相互作用