第二章 微生物发酵制药常用菌种的分离 2015-3幻灯片.ppt

1、微生物发酵制药常用菌种的分离,工业发酵生产水平的高低取决于生产菌种、发酵工艺和后提取工艺三个因素。拥有良好的生产菌种是提高生产水平的前提，除了提高产量，菌种选育还能提高产品质量、改善加工工艺和开发新产品。在科学研究中通过菌种选育还可以了解菌种的遗传学性质，因此，在生产和科研中，菌种选育都具有重要意义。,1,知识目标1、了解工业发酵制药常见微生物及其代谢物。2、了解各种菌种保藏原理以及主要菌种保藏机构。3、理解次级代谢产物与初级代谢产物的关系。4、理解工业发酵对生产菌种的要求及菌种来源。5、掌握自然选育、诱变育种的操作要点。6、掌握菌种保藏中常用方法的操作要点。,2,能力目标1、能利用自然选育技

2、术对生产菌种进行纯种分离或复壮。2、能利用诱变育种技术对生产菌种进行紫外诱变或化学诱变选育。3、能对生产菌种进行合理保藏。,3,第一节工业发酵生产菌种,一、工业发酵微生物及其代谢产物（一）微生物代谢产物的类型1、初级代谢产物2、次级代谢产物,4,初级代谢和初级代谢产物,初级代谢主要是指把营养物质转化为机体结构和生理活性物质以及提供能量的代谢作用。微生物通过初级代谢途径产生自身生长繁殖所必需的代谢产物称之为初级代谢产物。如氨基酸、核苷酸、蛋白质、多糖等。,5,次级代谢和次级代谢产物,次级代谢是指微生物在一定的生理阶段出现的一种特殊代谢类型，是某些微生物为了避免在代谢过程中某些代谢产物累积造成的不

3、利作用而产生的一类有利于生存的代谢类型。次级代谢产物是通过次级代谢合成的产物，通常在生产后期合成，如抗生素、色素、激素、毒素等。,6,3、次级代谢产物和初级代谢产物的关系,对产生菌的生长繁殖作用不同，但生物合成途径是相互关联的，初级代谢产生的一些小分子化合物是次级代谢途径的原料。,7,从代谢途径看，次级代谢产物是以初级代谢产物作为前体衍生出来的。菌体代谢过程中产生的某些中间产物既可以合成初级代谢产物，也可以合成次级代谢产物，这些中间产物称为“分叉中间体”。从酶学关系看，有些酶具有通用性，此外，某些初级产物对次级产代谢有一定调节作用。从遗传控制看，初级代谢与次级代谢都受到核内遗传物质的控制，抗生

4、素合成受到核外遗传物质质粒的控制，称为“质粒产物。,8,常见微生物1、细菌2、放线菌3、酵母菌4、霉菌,（二）工业发酵常见微生物及其代谢产物,9,1.细菌（bacteria）及其代谢产物,醋杆菌属（Acetobacter）：醋酸、山梨醇乳杆菌属（Lactobacillus）：乳酸、乳制品芽孢杆菌属（Bacillus）：丙酮、乙醇、丁醇、淀粉酶、蛋白酶、果胶酶假单胞菌属（Pseudomonas）：维生素B12、色素黄单胞菌属（Xanthomonas）：维生素B12、黄原胶,10,2.放线菌（actinomyces）及其代谢产物主要代谢产物是抗生素（antibiotic）：链霉素、土霉素、金霉素、

5、卡那霉素等，此外还用于维生素和酶制剂的生产。链霉菌（Streptomyces）小单孢菌属（Micromonospora）,11,3、霉菌（mould）及其代谢产物（1）曲霉属（Aspergillus）黑曲霉（A.niger）米曲霉（A.oryzae）黄曲霉（A.flavus）（2）青霉属（Penicillum）（3）根霉属（Rhizopus）米根霉（R.oryzae）华根霉（R.chinensis）（4）红曲霉属（Monascus）,12,霉菌菌落,13,霉菌菌落,14,4、酵母（yeast）及其代谢产物酵母属（Saccharomyces）啤酒酵母（Saccharomycescerevisia

6、e）2.假丝酵母属（Candida）产朊假丝酵母（Candidautilis）3.毕赤酵母属（Pichia）含丰富的蛋白质、维生素、酶，制造单细胞蛋白、酿酒,15,1.担子菌（basidiomycetes）即菇类（mushroom）2.藻类（alga）,5、其它微生物,16,二、工业发酵对生产菌种的一般要求1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。2.易控制培养条件，糖浓度、pH、温度、溶解氧3.生长迅速、产物生成快，发酵周期较短。4、选择单产高的营养缺陷型突变株或野生菌株5.选择抗杂菌和噬菌体的能力强的菌株。6.不易变异和退化，不产生任何有害物质和毒素。,17,三、工业发酵生产菌种来源,1、从

7、自然界分离筛选。2、从菌种保藏机构获得。3、从生产过程中已有菌株筛选发生正突变的优良菌种。,18,第二节生产菌种的选育发酵工业所需优良菌种都是通过菌种选育获得的，菌种选育方法主要包括自然选育、诱变选育、杂交育种和基因工程育种。,19,一、自然选育,在生产过程中，不经过人工诱变处理，利用菌株的自发突变而进行菌种筛选的过程，称为自然选育或自然分离。自然选育的菌种来源于自然界、菌种保藏机构或生产过程，其中从自然界选育菌种过程较为复杂。,20,自然选育的主要步骤,1.采样：有针对性地采集样品2.增殖培养：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势3.培养分离：利用分离技术得到纯种

8、4.筛选或毒性鉴定：进行生产性能测定和毒性测定,21,（一）采样,1、采样地点：以土壤为主，也可以是植物、腐败物品、水域2、采样地点确定方法：3、采样方法：去除表层5厘米左右浮土，取5-25cm处的土样10-25g，装入事先准备好的无菌塑料袋内扎好，记录采样时间、地点、土壤质地、植被名称以及具体的环境条件，以备查考，并尽快分离。,22,（二）富集培养,由于采集样品中各种微生物数量有很大差异，要分离的菌种数量不多时，就要人为增加分离的概率，增加该菌种的数量，称为富集培养。常用富集培养方法：（1）控制培养基成分（2）控制培养条件（3）抑制不需要的菌类,23,（三）纯种分离（1）划线分离法：简单、快

9、捷。（2）稀释分离法：菌落单一均匀。（3）组织分离法：适用于高等真菌,24,1、划线分离法操作步骤,25,接种针先以火焰灭菌法灭菌,步骤一,26,轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却,步骤二,27,以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。,步骤三,28,更换一个新的无菌营养平板,步骤四,29,将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区。,步骤五,30,重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。,步骤六,31,由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上图。,步骤七,32,重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中划出第三区，如右上图。,步骤八,33,重复第六以及第七步骤，由第

10、八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营养平板，如右上图。,步骤九,34,在营养平板上贴好标签（注意不能在皿盖上标签，以防混乱），标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及培养基名称。,步骤十,35,36,37,38,39,40,2、稀释分离法步骤,41,42,取1克土样，在火焰旁放入装有99毫克无菌水的锥形瓶内，充分摇匀，将菌分散。用移液管吸取上述菌悬液1毫升，放入盛有9毫升无菌水的试管中，并进一步稀释成1000倍，即10-3的菌悬液。按10倍稀释法连续稀释到10-8（每1次稀释，都须更换移液管）。取3支1毫升移液管分别从10-8、10-7、10-6菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别

11、注入编号10-8、10-7和10-6的培养皿内，同一稀释液重复做3个培养皿。,43,将温度为4550的营养琼脂培养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。（稀释倒平板法）经过一定时间培养后，培养基上长出菌落，根据菌落特征，初步判断属于何种类型的微生物，并在显微镜下检查，若菌体形态一致，则可认为是初步分离到纯菌种。将分离培养所得的纯菌种，从平板培养基转移到试管斜面培养基上培养。,44,需要使用的仪器震荡机,45,吸取准备好欲稀释的菌液,46,吸取充分均匀后的菌液,47,取含有9mL无菌水之试管，将试管口过

12、火灭菌。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。,48,将试管于震荡机上，使菌液混合均匀,49,取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL，加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。,50,从最后稀释菌液中吸取0.1mL菌液，置入准备好的无菌琼脂内。,51,将三角玻璃棒浸于酒精中,52,将三角玻璃棒在火焰上燃烧（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）,53,使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。（涂布平板法）,54,55,纯种分离培养条件的控制,1、营养成分控制2、控制培养基的酸碱度3、添加抑制剂4

13、、热处理5、控制培养温度6、通气条件控制,56,（四）生产能力的考察一般采用两步法：初筛：以量为主，包括平板筛选和摇瓶发酵筛选，筛选出少量生产能力较高的菌株。复筛：以质为主，一个菌株3-5个平行，培养后的发酵液必需采用精确分析方法测定。复筛出的菌株作为进一步诱变育种的出发菌株。,57,微生物平板选择分离的方法,1、变色圈法2、透明圈法3、生长圈法4、抑菌圈法,58,变色圈法：,变色圈法：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。如筛选果胶酶产生菌时，用含0.2%果胶为惟一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2

14、%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。在分离谷氨酸产生菌时，可在培养基中加入溴百里酚蓝，它是一种酸碱指示剂，变色范围在pH6.27.6，当pH在6.2以下时为黄色，pH7.6以上为蓝色。若平板上出现产酸菌，其菌落周围会变成黄色，可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌。,59,变色圈法,60,变色圈法,61,透明圈法,透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉

15、眼可见的透明圈。,62,透明圈法,63,透明圈法,64,透明圈法,65,透明圈法,66,生长圈法,生长圈法：生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌（如E.coliP264）与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌。,67,营养缺陷型,营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或者自然突变失去合成某种营养（氨基酸，维生素，核酸等）的能力，只

16、有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长，成为营养缺陷型（auxotroph）。营养缺陷型是一种生化突变株，它的出现是由基因突变引起的。,68,生长圈法,69,抑菌圈法,抑菌圈法：常用于抗生素产生菌的分离筛选，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。,70,抑菌圈法,71,2课时结束,72,二、诱变育种利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，扩大变异幅度，通过一定的筛选方法获取所需要优良菌株的过程，称为诱变育种。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。,诱变剂,物理：紫外线，快中子，

17、射线,化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍,73,（一）诱变育种的一般步骤（1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液诱变（2）用合适的方法淘汰负效应变异株，选出性能优良的正变异株筛选,74,（二）诱变育种应注意的问题,1、出发菌株的选择2、诱变因素的选择3、诱变剂剂量的选择4、单孢子（或单细胞）悬液的制备,75,1、出发菌株的选择,挑选原则：具备特别生产性能和潜能、对诱变剂敏感。变异幅度广。（1）野生型菌株（2）生产选育个高产菌株（3）已经诱变过的菌株：复杂，较易产生负突变。,76,2、诱变因素的选择,1、物理诱变剂：紫外线（UV），伽马射线2、化学诱变剂：硫酸二乙酯，亚硝基胍（NTG）1、单一诱变剂处理2、复

18、合诱变剂处理,诱变剂,诱变方法,77,3、诱变剂剂量的选择,诱变剂剂量与致死率有关，而致死率和诱变率有一定关系，因此，可用致死率作为各种诱变剂的相对剂量，目前诱变剂处理剂量一般选择死亡率为70-80的剂量，多核细胞有时也用90以上的高剂量，可减少回复突变。,78,4、单孢子（或单细胞）悬液的制备,诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。菌悬液制备方法：玻璃珠振荡打散后再用脱脂棉花或滤纸过滤，细胞浓度一般控制为：孢子或酵母细胞106-107个/mL；放线菌或细菌108个/mL，菌悬液一般用0.85的生理盐水稀释，化学诱变剂处理时用0.1mol/L磷

19、酸缓冲溶液稀释。,79,（三）常用的物理诱变剂处理方法,1、紫外线诱变紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253.7nm灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。,80,被照射的菌悬液细胞数，细菌为108个mL左右，霉菌孢子和酵母细胞为106107个mL。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。,81,紫外诱变的操作步骤,（1）制备菌悬液将细菌培

20、养液以3000rmin离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个mL左右，作为待处理菌悬液。,82,（2）紫外线照射,取24m1制备的菌液加到直径7cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线20min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射一定时间。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。,83,（3）后培养与稀释涂布,照射完毕后将菌

21、悬液在适宜温度下暗培养1-2h，取未照射的制备菌液和照射菌液按一定稀释度进行稀释，然后吸取稀释液涂平板，计数活菌细胞数。挑取菌落进行筛选。（教材实训四）,84,2、伽马射线诱变,常用的微生物诱变辐射源。剂量单位以伦琴（R）表示，穿透力强，致死作用比紫外线强烈，不宜反复照射。3、太空育种利用微重力等太空因素引发突变。,85,（四）常用的化学诱变剂处理方法,1、亚硝酸诱变2、亚硝基胍（NTG）诱变3、硫酸二乙酯（DES）诱变,86,亚硝基胍（NTG）诱变,N甲基N-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用，有“超诱变剂”之称，能使细胞发生一次或多次突变，诱变

22、效果好，尤其适用于诱发营养缺陷型突变株。注意不同的水溶液pH值影响诱变效应。,87,亚硝基胍（NTG）诱变操作步骤,1单孢子悬液制备：取斜面，加入6ml0.1molLpH6.o的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达l06个ml，此为待处理孢子悬液。2NTG溶液的制备用分析天平称取2mg，加入2ml0.1molLpH6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。,88,3诱变处理吸取NTG溶液lml，加入到1m1孢子悬液中，30振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-2，10-4两个稀释度分离培养，303天后计数。

23、4死亡率计算将未处理的孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离，30下培养3天。根据处理前后的活孢子数可计算出死亡率。5挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选,89,亚硝基胍（NTG）诱变注意事项,NTG是一种强烈的致癌物质，操作时一定要穿工作服，戴橡皮手套、口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行，凡接触过NTG的器皿必需及时、单独处理，可用自来水大量冲洗或用1-2mol/L的NaOH浸泡过夜，洗净。,90,三、杂交育种,杂交育种一般指两个基因型不同的菌株通过结合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。杂交育种可以消除菌株经长期诱变处理出现的产量上升缓慢的现象，通过杂交可以改变产品质量和产量，甚至形成新品种，近年普遍采用的杂交方法是原生质体融合。,91,原生质体融合（protoplastfusion）1.标记菌株的筛选2.原生质体的制备3.原生质体的融合与再生聚乙二醇（PEG）脱水剂助融剂Ca2+提高融合频率4.融合子的选择,92,四、基因工程育种,基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在