质粒DNA的提取及浓度测定PPT课件.ppt

1、实验一质粒DNA的提取及浓度检测,1,目的与要求通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。,2,2.相关知识及原理,质粒(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。,3,4,5,DNA超螺旋结构,6,细菌质粒:细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。,7,严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。

2、所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。,质粒类型：,8,载体(Vector)：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。,具备的条件：易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；易于筛选；易于导入受体细胞。,9,抗性基因（Antibioticresistancegene,suchasAmpicillinresistancegene,Kan

3、amycineresistancegene)启始复制子（ori,Originofreplication)；多克隆位点(MSC,Multiplecloningsiteorpolylinker)；标记基因(Markergene,suchasLacZgene)。,载体的结构：,10,11,DNA是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。,原理：,12,SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从

4、细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。,13,细菌裂解的方法：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。,14,测定DNA浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。另

5、外还有一种用于粗略检测DNA浓度的方法是通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。,DNA浓度的测定：,15,紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。,16,3.材料与试剂材料:含有质粒pCMV-Myc-T10的大肠杆菌DH5。pCMV-Myc是一种哺乳细胞表达载体，它含有一个N端c-Myc尾，常用于免疫反应的检测和蛋白纯化以及作为诱饵蛋白检测酵母双杂交结果。,Suitablehos

6、tstrains:DH5a,HB101,andothergeneralpurposestrains.Selectablemarker:plasmidconfersresistancetoampicillin(100mg/ml)toE.colihosts.E.colireplicationorigin:pUCCopynumber:500,17,pCMV-Myc-T10,18,4.步骤质粒DNA的提取碱裂解法,19,溶液1GET缓冲液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mMTris-HClpH8.0。溶液20.2mol/LNaOH,1%SDS溶液3乙酸钾溶液(3M,pH=4.8

7、)：60mL的5mol/LKAc,11.5ml冰醋酸，28.5mLH2OTE缓冲液或水（+20g/mlRNase）:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA，pH8.0,100%乙醇，70乙醇,20,注意：用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！,21,培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37培养1216小时;取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100l溶液1(GET)，充分

8、混匀放置3-5分钟;加入200l新配制的0.2mol/LNaOH+1SDS（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;,质粒小量提取的方法（手工提取）：,22,加入150l乙酸钾溶液(溶液II)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min;用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml100乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液;沉淀用0.5ml70乙醇清洗一次，12000r/min离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥;加入30-50l含有20g/mlRNase的灭菌蒸馏水或TE缓冲液溶解提取物，

9、室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);将分离出的质粒DNA置于-20保存备用。,23,Biodev（博大泰克）质粒快速提取试剂盒（plasmidrapidisolationkit）,碱裂解法；离心柱结构；特殊硅基质吸附材料。,使用前按说明再溶液I中加入RNase；向洗脱液中按1:3的比例加入无水乙醇。,24,操作步骤,收集1.53ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。加入100l溶液1，振荡至彻底悬浮。为了获得高质量的质粒DNA，培养细菌的时间不宜过长，一般为12小时；细菌沉淀中加入溶液1后，一定要彻底悬浮，否则抽提质粒DNA的纯度及得率会大大降低加入150l溶液2，

10、立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。随后将离心管冰上放置12分钟（时间勿超）。,25,加入150l溶液3，立即温和颠倒离心管数次，室温放置5分钟。12000rpm离心12分钟。要获得更好得质粒提取效果，请于步骤2和步骤3后，冰上放置。将420l结合缓冲液加入离心柱中。然后将步骤3的上清加入离心吸附柱中（尽量去除杂质），混匀。12000rpm离心30秒钟。倒掉废液收集管中得溶液。加入750l洗涤缓冲液于离心吸附柱中，12000rpm离心1分钟。,26,浓缩漂洗液配置成工作浓度时，一定要使用无水乙醇，否则，吸附于硅基质材料上的DNA可能被洗脱下来，影响回收效率。A.重复步

11、骤5一次；B.随后，再次于12000rpm空管离心2分钟，尽量除去漂洗液。洗涕时（即步骤5和6）一定要尽量除去漂洗液，否则，漂洗液中得乙醇会抑制后续得各种酶促反应。必要时，可适当延长离心时间或者用Tip头吸净。,27,如果含有较多得蛋白、盐类等杂质，可多洗涤几次。小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管中。加入50l洗脱缓冲液，室温放置5分钟后，12000rpm离心1分钟。洗脱缓冲液一定要加入离心吸附柱中硅基质材料得正中，以确保被吸附在硅基质材料中得DNA都能被洗脱下来。为提高回收效率，可适当加大洗脱液体积及洗脱次数。,28,为了充分除尽RNA的污染，可在提取的质粒中加入0.5l

12、RNaseA（10mg/ml）。这并不影响其他后续实验，所提取的质粒的纯度足以用来作为测序模板和其他酶促反应。若提取的质粒大于10Kb，在加入洗脱缓冲液后，可在70水浴中放置35分钟，以确保质粒DNA的完全洗脱。,29,B.用分光光度计法定量DNA取2l提取的质粒DNA，加入98l蒸馏水对待测DNA样品做1:50(或更高倍数的稀释);蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。,30,加入DNA稀释液，测定260nm及280nm的吸收值。260nm读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50g/ml双链DNA，33g/ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。,31,记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下:dsDNA=50(OD260)稀释倍数以上浓度单位为g/ml,32,C.凝胶电泳检测DNA的浓度,0.8%的琼脂糖凝胶，100V,40分钟。NEB标准分子量片段(1