第二章-氨基酸和多肽的生物有机化学(上).ppt

1、1,第 二 章,氨基酸和多肽的生物有机化学 （上）,2,2.1 蛋白质、多肽和氨基酸,蛋白质是生命体中含量最丰富、功能最重要的一类生物大分子。它存在于所有的生物细胞中，约占细胞干质量的50%以上。,蛋白质的主要功能包括以下几方面： 催化功能：酶催化生命过程中的一切生物化学变 化。绝大多数酶是由蛋白质组成的。 免疫防御作用：生物体能够产生蛋白质抗体，是 防御外来细菌或病毒入侵的基本机制。,3, 转运功能 ：转运蛋白能够携带各种物质通过细胞 膜，维持正常的物质交换过程。 调控作用：生物体内的许多激素，如胰岛素等以及 它们的受体，大都是由蛋白质产生或构成的。这些 调控蛋白质在许多生命过程中起着重要的

2、调控作用。 形成生物体的基本形体结构：如动物的骨骼、肌肉、 皮肤等结构物质的成分，主要由各种蛋白质组成。 运动功能：肌肉蛋白的拉伸和收缩产生各种形态的 运动。 神经剌激的产生和传导。,4,蛋白质的功能极其复杂，其结构也很复杂。蛋白质的结构主要包括三个方面：蛋白质的基本组成、连接方式和空间结构。,蛋白质和多肽用化学方法或酶完全水解，得到的基本产物是各种不同的氨基酸。所以，氨基酸是蛋白质和多肽的结构单元分子。,多肽是由各种不同的氨基酸按一定的方式连接而成的生物大分子。它在生物体内可以单独存在，但是更多的则是作为蛋白质的亚单位。,5,蛋白质是由一个或多个多肽链通过特殊价键结合而成。应用化学和物理方法

3、，可以将蛋白质拆分成多肽组分。,2.2 氨基酸,虽然蛋白质种类繁多，但是所有蛋白质都是由 20种基本氨基酸构成的。20种基本氨基酸具有如下结构特点。,1. -氨基酸的结构,6, 都是-氨基酸。 -碳原子为手性中心（甘氨酸例外），均为L- 构型，具有旋光性。 R称为氨基酸的侧链，是-氨基酸分子中唯一的 可变化部分。R不同可以衍生出不同的-氨基酸。,7,2. -氨基酸的离解性质,从结构上看，-氨基酸分子中含有羧基（-COOH）和氨基（-NH2）。从它们的物理化学性质上看，所有的-氨基酸都是不挥发的结晶固体，熔点很高（分解 ），不溶于非极性溶剂，如苯、石油醚等，而易溶于水。这些性质与典型的羧酸（R-

4、COOH）或胺（R-NH2）明显不相同。,8,实际上，氨基酸在结晶形态或在接近中性的溶液中，并不以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子（dipolar ion）。在两性离子中，氨基是质子化的（-NH3+）， 羧基是离解状态的（-COO-）。,9,在溶液中，当 pH 发生变化时，两性离子状态也随之发生变化：,当溶液为某一pH值时，氨基酸分子中所含的（-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH 值即称为氨基酸的等电点（isoelectric point, 简称 pI）。,10,不同的氨基酸具有不同的等电点。氨基酸的等电点与氨基酸中可离解基团的pKa关系，可以从甘氨酸的碱滴定曲

5、线来说明：,11,氨基酸的等电点和可离解基团pKa值见表2-1。,12,13,从表2-1可以看出，氨基酸羧基的pKa值在1.82.6，比典型羧基的pKa（如乙酸的pKa为4.76）要小得多。说明氨基酸羧基酸性比普通羧基强100 倍以上。主要原因是氨基酸中-氨基对羧基离解的影响。,14,3. 氨基酸的侧链性质一-氨基酸的分类,-氨基酸的侧链不同，性质也有明显差别。根据氨基酸侧链性质，可以将20种基本氨基酸分以下几类。, R为脂肪烃基的氨基酸：属于这类氨基酸的有以下 五种：,15,这类氨基酸的R基均为中性烷基（甘氨酸为H）， 因此R基团对分子酸碱性影响很小。它们都具有几乎相同的等电点为（5.60.

6、5）。以上五种氨基酸中，由丙氨酸到异亮氨酸，R基团疏水性逐渐增加。异亮氨酸是 20种氨基酸中脂溶性最强的氨基酸之一。,16, R中含有羟基和硫的氨基酸：R中含有羟基的氨基 酸有两种：,丝氨酸中的-CH2OH基（pKa15），在普通生理条件下，并不发生离解。但是它是一个极性基团，能够与其他的基团形成氢键，因此具有重要的生理意义 。在大多数酶的活性中心都发现有丝氨酸残基存在。,17,苏氨酸中的羟基是第二醇羟基。虽然苏氨酸也有较好的亲水性能，但由于羟基形成氢键能力较弱，因此在蛋白质活性中心组成中发现较少。,R中含有巯基（-SH）的氨基酸是半胱氨酸：,18,半胱氨酸重要性质之一：在较高pH值条件下，巯

7、基能发生离解作用：,半胱氨酸重要性质之二：两个半胱氨酸的疏基能被氧化形成二硫键（disulfide bond）。两个半胱氨酸通过二硫键连接而成的化合物被称为胱氨酸（cystine）。,19,由半胱氨酸形成的二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义。,20,R中含有甲硫基（-SCH3）的氨基酸是甲硫氨酸 （methionine）。,由于硫原子的亲核性和容易发生极化，因此甲硫氨酸在生物合成中是一种重要的甲基供体。,21, R中含有芳基的氨基酸：属于这类氨基酸的有三种：,这三种氨基酸共同的特点是具有一个共轭电子体系，容易与其他缺电子体系或电子体系形成电荷转移复合物（charge-transfer comp

8、lex）或电子重叠复合物。,22,因此在受体-底物相互作用，或分子识别过程中具有重要作用。,这三种氨基酸都在紫外区有特殊吸收峰（见图2-2）。蛋白质的紫外吸收特性主要来自上述三种氨基酸的贡献。大多数蛋白质紫外吸收范围在280nm左右。,23,24,苯丙氨酸疏水性最强。酪氨酸由于存在酚羟基，在较高pH值下容易离解（pKR值见表2-1）。 色氨酸含有复杂的共扼体系，因此比苯丙氨酸和酪氨酸更易于形成电荷转移络合物。,25, R中含有碱性基团的氨基酸：组氨酸、赖氨酸和精 氨酸的R中含有碱性基团，因此一般被称为碱性氨 基酸。,组氨酸含有咪唑环，因而具有特殊化学性质。一个重要的特性是其咪唑环的pKa值在游

9、离的氨基酸中和在多肽链中不同。前者的pKa值为6.00，后者为7.35。它是20种基本氨基酸中侧链R的pKa最接近生理pH值的一种。因此它能在接近中性pH条件下，发生如下的离解平衡过程：,26,组氨酸的一个重要的特点是咪唑环的一侧去质子化和另一侧质子化过程同步进行。因而在酶的酸碱催化机制中起着重要的作用。组氨酸中含有三个可离解的基团。它们的pK值见表2-1。,27,赖氨酸的R中含有第二个氨基：,侧链氨基的pKa值为10.53。在生理条件下，赖氨酸的侧链带有一正电荷 （NH3+）。同时，它的侧链是一个包括4个碳的直链烷基，因此柔顺性比较大。,28,精氨酸是碱性最强的一种氨基酸。,侧链上所含的胍基

10、（guanidine）是已知碱性最强的有机碱，它的pKa 值为12.48。 在生理条件 下，胍基几乎完全质子化。,29, R中含有酸性基团的氨基酸：这类氨基酸又称为 酸性氨基酸。它们是门冬氨酸和谷氨酸。,30,门冬氨酸侧链羧基的pKa（ -COOH）值为 3.65，谷氨酸侧链羧基的pKa（-COOH）值为4.25。它们是在生理条件下带有负电荷的仅有的两个氨基酸。, R中含有酰胺基的氨基酸：门冬酰胺和谷氨酰胺 分别是门冬氨酸和谷氨酸的酰胺化产物。,酰胺基中的氨基很容易发生氨基转移反应。这种转氨基反应在生物合成和代谢中具有重要意义。,31, R为环状的氨基酸：脯氨酸是20种基本氨基酸中 唯一的一种

11、R为环状结构的氨基酸。它的-氨 基是环的组成部分之一。因此脯氨酸具有特殊 的刚性结构。,32,在多肽链中，在脯氨酸残基所在位置必然会发生骨架方向的变化，所以它在蛋白质的立体结构中具有重要作用。,33,4. 氨基酸的重要反应, 烷基化反应：氨基酸烷基化反应主要包括两类, -氨基的烷基化反应：-氨基中的氮是一个很 好的亲核中心，因此能发生亲核取代反应。肌氨 酸（sarcosine）是存在于生物组织中的一种重 要生物分子。它是甘氨酸甲基化产物：,34,某些具有强亲电性质的有机化合物能与-氨基发生烷基化反应。如在第一次世界大战中使用的一种著名毒气芥子气 （mustard gases），它的主要作用是使

12、氨基酸-氨基发生烷基化反应，从而破坏了蛋白质的正常功能。,35,-氨基的烷基化在蛋白质的氨基酸顺序分析中也极为重要。如2,4-二硝基氟苯（2,4- dinitroflu -orobenzene，简称DNF）与氨基酸的反应是蛋白质N-端氨基酸分析法的基础。,36,氨基酸与邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde）反应生成具有强的荧光性质的产物，是现代氨基酸微量分析的重要方法之一。,37,氨基酸的氨基与醛基形成 Schiff 碱的反应也是氨基酸烷基化的重要类型。, 含硫氨基酸的烷基化反应：氨基酸中含有其他的 亲核中心，如硫原子，也可以发生亲核取代反应。 在生物体内，最重要的甲基化剂是S-腺苷甲

13、硫氨 酸 （S-adenosylmethionine,SAM）。它是由 甲硫氨酸与ATP作用得到的S-烷基化产物：,ATP(adenosine triphosphate, 三磷酸腺苷 ),38,在酶催化下，SAM可以使多种生物分子的氨基烷基化。例如磷脂酰胆碱的合成反应：,39,+,40, 酰基化反应：酰基化反应是氨基酸最重要的一类反 应。氨基酸的-氨基与适当的酰基化剂作用可以得 到酰胺：,+,41,在生物体内，氨基酸之间发生的酰基化反应生成多肽是蛋白质生物合成的基础。,一个氨基酸分子的羧基与另一个氨基酸分子的氨基发生酰基化反应生成酰胺键在蛋白质化学中通常称为肽键。,42,形成肽键的反应从热力学

14、上看是一个不能自发进行的反应。因此在通常情况下是不能自发进行的。多肽的生物合成是一个非常复杂的过程，将在以后进行讨论。,在酶和ATP存在条件下，羧酸也可以与氨基酸的氨基作用，形成酰基化产物。例如苯甲酸与甘氨酸氨基的酰基化反应是生物体内解毒作用（detoxi -cation）的一个典型例子。,43,将经过匀浆的动物肝脏组织与甘氨酸、苯甲酸和ATP混合保温，则从混合液中可以分离得到N-苯甲酰-甘氨酸（N-benzoyl glycine）。苯甲酸是最常用的一种食品防腐剂，它在生物体内通过这一反应转变成N-苯甲酰-甘氨酸后，经尿中排出。 主要反应过程如下所示。,44,45, 脱氨基作用：氨基酸脱氨基反

15、应是氨基酸代谢的重 要反应，是氨基酸转氨作用和进一步合成或分解代 谢的基础。反应产物一般是游离的NH3和-酮酸 （-keto acid）。,磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate）是转氨酶（transaminases）的重要辅酶。,46,它催化氨基酸转氨基反应过程如下：,47,48, 脱羧基作用：氨基酸在脱羧酶（decarboxylase） 的作用下脱羧生成胺：,这一反应在正常动物体组织中是很少发生的， 它是蛋白质腐败过程的重要反应。在动物体内氨基酸的正常脱羧反应一般是在磷酸毗哆素为辅酶的脱羧酶催化下进行的。,49,反应的产物GABA是一种神经传导的抑制剂。,50,2.3 肽键和多

16、肽,氨基酸通过肽键连接起来的化合物称为肽（pe -ptides）。由多个氨基酸组成的肽则称为多肽（po -lypeptides）。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基（amino acid residues）。多肽广泛存在于自然界中，但最重要的是作为蛋白质的亚单位存在。,1. 肽键,一分子氨基酸的羧基与另一分子氨基酸的氨基反应，脱去一分子水形成的酰胺键，称为肽键（peptide bond）。,51,肽键最重要的一个特点是具有平面型杂化结构，两种共振形式同时存在。,肽键中C-N键具有部分双键的性质，因此组成酰胺键的原子处于同一平面。,52,由于肽键中C-N键不能自由旋转，因此存在顺反两种可能的构型

17、。,在大多数情况下，反式构型在能量上更有利。但也有例外，如果氨基酸顺序是X-pro(X为任何其他氨基酸)，则以顺式构型为有利。,53,2. 多肽,多肽是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成的化合物。多肽中氨基酸的排列顺序称为氨基酸顺序（amino acid sequence），是多肽和蛋白质最重要的特性之一。,下面是一个由四个氨基酸组成的四肽：,54,任何一条肽链，都有两个终端，即含有游离的 NH3+的一端和含有-COO-的一端。前者称为N-端，后者称为C-端。氨基酸顺序是指由N-端开始，以C-端为终点的氨基酸排列顺序。如上述四肽的氨基酸顺序为：,由于多肽分子中含有游离的N-端氨基和

18、C-端羧基，以及氨基酸残基侧链中可离解基团，因此多肽可以看成是一个“大氨基酸 ”。它的离解性质与简单的氨基酸相似，但情况要复杂得多。,55,多肽也有等电点。等电点时，分子中所含的正电荷基团与负电荷基团数目正好相等，净电荷为零。多肽在其等电点时，具有一些特殊性质，如溶解度最小，电泳时不能移动等。,56,2.4 蛋白质的结构,蛋白质是由一条或多条多肽链以特殊方式组合成的生物大分子。蛋白质结构非常复杂，主要包括以肽链结构为基础的肽链线形序列（一级结构），以及由肽链蜷曲、折叠而形成的三维结构（通常又分为二、三和四级结构）。,1. 蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构包括组成蛋白质的多肽链数目，每一条多肽

19、链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键数目和位置。,57,现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被研究清楚。例如，胰岛素是由动物胰岛分泌出来的一种重要的蛋白质激素。它的一级结构如图2-4所示：,58,2. 蛋白质的三维结构,任何一个蛋白质，在其自然状态或活性状态下 , 都具有特征而稳定的三维结构（three dime nsional structure）。 一旦这种特征的三维结构遭到破坏， 即使它的一级结构不变，蛋白质的生物功能也会完全丧失。所以，具有独特的三维结构，是蛋白质区别于普通有机分子最显著的特征。,最早研究蛋白质空间结构的是本世纪伟大的化学家Pauling L。在30年代，他就开始应

20、用X衍射的方法来研究蛋白质的晶体结构。,59,1951年，Pauling 根据其研究结果，首先提出了蛋白质的立体结构模型：-螺旋（-helix）和 -折叠（-sheet）。现在，蛋白质空间结构研究已经成了一个重要的研究领域。,蛋白质的三维结构可以进一步分为二级结构、三级结构和四级结构。,蛋白质的二级结构是指肽链的主链在空间的排列。它只涉及分子主链的构象及链内或链间所形成的氢键。,多肽链的构象主要取决于下面两个条件：,60, 组成肽键的原子都处于同一平面。在肽链中 ，两个相邻的肽键通过一个共同的-碳（C）相接，而C-N和C-C键是可以自由旋转的。,因此肽链可以在保持酰胺键平面结构不变情况下，形成

21、不同的空间排列。例如多肽链可以是折叠的，也可以是伸展的。,61, 主链上酰胺键中的-C=O基和-N-H基容易形成链间或链内的氢键：,这种氢键对于稳定主链构象具有重要意义。因此在各种可能的构象中，能够形成氢键最多的构象将是最稳定的。,在蛋白质二级结构中，最重要的是-螺旋和-折叠。,62,63,64,在-螺旋中，氢键是由同一条主链上的-NH 和-C=O之间形成的，在-折叠中，氢键则由相互平行的主链之间的-N-H和-C=O之间形成的。,蛋白质的三级结构，是在二级结构基础上，在空间进一步盘绕、折叠形成的，包括主、侧链构象在内的特征的三维结构。由于它比二级结构更复杂和精细，目前知道的还不多。,蛋白质的四

22、级结构是以三级结构的多肽为基础，以某种形式聚合成蛋白质大分子。对于四级结构的研究，目前还很少涉及。,65,2.5 多肽结构分析中的化学反应,多肽的结构分析是蛋白质化学的重要基础。其中涉及到许多重要的反应。,1. 多肽链的选择性水解,一般的多肽链太长，含有几百甚至几千个氨基酸残基，因此，必须先将它切割成若干个小肽段。然后再分别测定小肽段的氨基酸顺序。,多肽链的降解，必须满足两个条件：选择性强，反应产率高。目前主要有酶解法和化学法两种。,66, 酶解法：某些蛋白水解酶（proteolitic enzy-mes）能特异性地水解多肽链中的某一类肽键， 因而能预测出可能得到的小肽段数目，以及端基氨基酸种

23、类。表2-2列出了几种常用的蛋白水解酶的水解特性。,67,68,酶选择性水解多肽链过程相当复杂。例如胰凝乳蛋白酶的反应中心主要包括：丝氨酸、组氨酸、门冬氨酸残基和一个疏水区，这三个氨基酸残基的作用是催化肽键水解。疏水区的作用是与Phe等具有疏水侧链的氨基酸缔合，是胰凝乳蛋白酶具有选择性水解特性的重要原因。, 化学法：一种比较理想的方法是溴化氰 （cyanogen bromide）水解法，它能选择性地切割甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。溴化氰水解过程如下：,69,70,此法的特点是专一性强，产率高。特别是，一般多肽中所含的甲硫氨酸数目较少，而且分布也比较分散，可以得到较理想的小肽段。,2. 多肽端基

24、氨基酸分析法,多肽分析，基本目的是要确定组成多肽的氨基酸顺序。多肽链端基的分析是氨基酸顺序分析的第一步。, N-端分析：N-端分析主要有以下三种方法。 Sanger方法：2,4-二硝基氟苯（DNF）在碱性条件下能与多肽链N-端的游离氨基作用（烷基化反应 ），生成二硝基苯衍生物（dinitrophenyl derivative DNP衍生物）。,71,然后进一步在酸性条件下水解，得到黄DNP- 氨基酸，并且可以用乙醚抽提。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法鉴定。,72, Dabsyl chloride法：Dabsyl chloride能与非离解状态的-NH2作用（碱性条件）生成sulfona mi

25、de的衍生物。在强酸性条件下（6mol/L盐酸）水解， 即得到有颜色的Dabsylated-氨基酸。,73, Dansyl chloride法：在碱性条件下，Dansyl chlo ride（丹磺酰氯）可以和N-端的游离氨基反应：,74,这一方法的过程与Dabsyl chloride法很相似。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,75, Edman方法：本法不仅可以测定N-端氨基酸，而且可以不断重复，直至完成整个多肽链的氨基酸顺序分析，是现代蛋白质氨基酸顺序自动分析仪的设计基础。,Edman法的基本化学反应过程如下：,异硫氰酸苯酯,76,苯胺基硫代甲

26、酸衍生物,77,这一方法的最大特点是在完成了上述三步反应后，产生的PTH-氨基酸（N-端）很容易被检测。 而多肽链的其余部分则完好无损，可以重复与PTC 作用。因而可以将多肽链从N-端开始，将氨基酸一个一个剪切下来进行分析鉴定。,苯基乙内酰硫脲衍生物,78,79,根据Edman原理设计的氨基酸顺序固相自动分析仪，可以顺利地测定只有110-3mg的多肽样品，自动化程度高，是目前应用很广的一种自动化分析仪器。, C-端分析法：多肽链C-端氨基酸测定方法不像N-端分析法那样理想，比较常用的主要有两种方法。 化学法：多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链中分离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼

27、化物能与苯甲醛缩合成非水溶性产物而与水溶性C-端氨基酸分开。,80,81, 酶解法：此法的基本原理是某些蛋白水解酶能特异性地水解C-端氨基酸。其中常用的酶是羧肽酶A(carboxypeptidase A)。如果C-端氨基酸的R基为芳香环或比较大的烃基，则水解反应更容易进行。,82,83,2.6 多肽链的反应,1. 多肽链的反应,多肽链氨基酸残基的侧链含有各种不同的活性基团，在适当条件下可以发生多种化学反应。 (1) 羟基的反应：侧链含有的羟基，可以发生酯化反应。如二异丙基磷酰氟（diisopropy phospho-flu oridate, 简写为 DIPF）是多种酶的抑制剂，其原因是DIPF能与酶活性中心的丝氨酸残基的羟基发生反应：,84,丝氨酸,85,(2) 含硫基团的反应：侧链上含有硫原子的氨基酸残基，容易发生氧化反应或亲核取代反应。形成二硫键反应：,这一反应可以在多肽链内或链间形