分子论文 利用ITS序列鉴定真菌

1、利用ITS序列鉴定真菌许文迎 李彦龙(北方民族大学，银川，750021) 摘要：【研究目的】了解利用ITS序列鉴定真菌的原理并掌握用ITS序列鉴定真菌的方法步骤；【方法】提取平菇基因组DNA后，对ITS基因组片段进行PCR扩增，并对ITS片段DNA的PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，再对ITS片段进行测序，最后对产物进行BLAST比对，鉴定属、种。【结果】运用ITS序列，可以鉴定出平菇属于pleurotus.，并对其作出评价【结论】平菇为真菌植物门真菌侧耳Pleurotusostreatus 关键词：平菇，ITS基因组，PCR扩增，BLAST比对Identify mushroom by usin

2、g ITS sequenceXU wen-ying LI yan-long（Beifang University of Nationality ,yinchuan 750021 )Abstract：【OBJECTIVE】To understand ITS sequence identification using the principle of fungi and master ITS sequence identification with the method of fungi steps;【METHOD】Oyster extract genomic DNA to ITS genome

3、fragments PCR amplification, and ITS fragments of DNA amplified PCR product for gel electrophoresis, again to ITS fragments sequencing, finally, the products were than BLAST, appraisal genera and kind.【RESULTS】 Use ITS sequence, can identify mushroom belongs to pleurotus., and ITS make evaluation【CO

4、NCLUSION】Based on the system tree, but also can judge it and the rest of the genetic relationship between bacteria.Key words: Oyster mushroom,ITS genome,PCR amplification,BLAST comparison1.引言 菌物是真核生物的重要类别，传统的菌物分类以子实体形态特征和生理生化指标为分类基础，由于部分菌物的子实体不易获得，形态特征不易掌握，少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，使传统的菌物鉴定工作困难或分类系统意

5、见分歧。内转录间隔区ITS（internal transcribed space），位于18S和5.8S rDNA（ITS1）之间以及58S和28S rDNA之间（ITS2），ITS1和ITS2常被合称为ITS，并且5.8S RNA基因也被包括在ITS之内。近年来，利用真核生物在rDNA的ITS区段既具保守性又在科、属、种水平上均有特异性序列的特性，对ITS区进行PCR扩增、测序。随着核糖体rDNA ITS序列分析技术在菌物研究中的应用，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了解决，一些重要的菌物遗传信息得到阐明。2、材料与方法2.1、试验时间、地点室内试验在2012年9月16

6、日于北方民族大学分子实验室进行。2.2、试验材料2.2.1、1.仪器、用具：恒温水浴锅，移液器，离心机，核酸蛋白分析仪，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像系统，PCR仪，离心管，微量移液器，枪头，一次性手套， PCR管 (0.2ml)；2.材料：真菌组织、菌丝体或孢子；3.试剂：基因组DNA提取，特异性片段的PCR扩增，ITS引物（F：CCGTAGGTGAACCTGCGG，R: TCCTCCGCTTATTGATATGC）。2.2.2、平菇样本 本研究使用的平菇样本为在超市购买的普通食用平菇2.2.3、所用测序仪器为ABI-PRISM3730，测序试剂为BigDyeterminatorv3.1。2.3

7、、试验方法2.3.1、基因组DNA提取1. CTAB溶液在65水浴中预热（使用前加入1%巯基乙醇）。2.取适量植物叶片置于研钵中，加入液氮，用小杵磨至粉状，研磨期间及时添加液氮防止高温氧化。3.液氮中预冷小勺和离心管，取0.1-0.2g的研磨样品放入1.5ml离心管中，加入700L的CTAB溶液，轻轻搅动摇匀，置于65的水浴槽中，每隔10min轻轻摇动，40 min后取出。4.室温冷却2min后，加入等体积Tris酚/氯仿/异戊醇溶液，颠倒混匀抽提15-20分钟。 5. 小心吸取上清液约600L，加入等体积氯仿抽提10分钟，室温放置2分钟，10000 r/min，离心10min。5.小心吸取上

8、清液约500L, 加入等体积异丙醇或者2倍体积的无水乙醇颠倒混合（此时能见到DNA絮状物）。6. 10000 r/min离心10min，倒掉液体，留下沉淀。注意勿将白色DNA沉淀倒出。7.加入1mL 70%的乙醇洗涤DNA沉淀，10000 r/min离心2min，倒掉液体，干燥DNA（超净台风干或自然风干）。8.沉淀风干透亮后加入50L TE缓冲液，使DNA溶解，置于-20保存、备用。2.3.2基因组DNA纯度、浓度的检测1、紫外分光光度检测： DNA的A280/A260约等于1.8， 在10mm 光路径、260nm条件下，1 OD的 DNA浓度约为50g/mL。 2、琼脂糖凝胶电泳检测：08

9、%凝胶，凝胶成像系统照相。2.3.3 ITS的PCR扩增引物、模板、DNA聚合酶、水。每次经过变性、退火、延伸三个步骤，重复30个循环获得大量DNA。2.3.4 ITS片段的琼脂糖凝胶电泳分析，观察DNA条带2.3.5 运用BLAST软件对ITS序列进行鉴定分析3、结果与分析3.1、原始数据ITS引物（F：CCGTAGGTGAACCTGCGG，R: TCCTCCGCTTATTGATATGC）。3.2、测序结果TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAATGAATTCACTATGGAGTTGTTGCTGGCCTCTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTCAA

10、CCACCTGTGAACTTTTGATAGATYTGTGAAGTCGTCTTTCAAGTCGTCAGACTTGGTTTGCTGGGATTTAAACGTCTCGGTGTGACAACGCAGTCTATTTACTTAACACACCCCAAATGTATGTCTACGAATGTCATTTAATGGRCCTTGTGCCTATAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGA

11、GGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCTCAAACTCACTTTGGTTTTTTCCAATTGTGATGTTTGGATTGTTGGGGGCTGCTGGCCTTGACAGGTCGGCTCCTCTTAAATGCATTAGCAGGACTTCTCATTGCCTCTGCGCATGATGTGATAATTATCACTCATCAATAGCACGCATGAATAGAGTCCAGCTCTCTAATCGTCCGCAAGGACAATTTGACAATTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA3.3用BLAST分析如图（高度

12、相似序列)AB733143.1Pleurotus ostreatus genes for 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA, partial and complete sequence, strain: NBRC 3016012451245100%0.0100%窗体顶端dbj|AB733143.1| Pleurotus ostreatus genes for 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA, partial and complete sequence, strain: NBRC 30160 L

13、ength=678 Score = 1245 bits (674), Expect = 0.0 Identities = 678/678 (100%), Gaps = 0/678 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAATGAATTCACTATGGAGTTGTTGCTGGCCT 60 | Sbjct 1 TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAATGAATTCACTATGGAGTTGTTGCTGGCCT 60 Query 61 CTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTCA

14、ACCACCTGTGAACTTTTGATAGATYTG 120 | Sbjct 61 CTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTCAACCACCTGTGAACTTTTGATAGATYTG 120 Query 121 TGAAGTCGTCTTTCAAGTCGTCAGACTTGGTTTGCTGGGATTTAAACGTCTCGGTGTGAC 180 | Sbjct 121 TGAAGTCGTCTTTCAAGTCGTCAGACTTGGTTTGCTGGGATTTAAACGTCTCGGTGTGAC 180 Query 181 AACGCAGTCTATTTACTTAACACACCCCAA

15、ATGTATGTCTACGAATGTCATTTAATGGRC 240 | Sbjct 181 AACGCAGTCTATTTACTTAACACACCCCAAATGTATGTCTACGAATGTCATTTAATGGRC 240 Query 241 CTTGTGCCTATAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGAT 300 | Sbjct 241 CTTGTGCCTATAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGAT 300 Query 301 GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGT

16、AATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAAT 360 | Sbjct 301 GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAAT 360 Query 361 CTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTA 420 | Sbjct 361 CTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTA 420 Query 421 AATTCTCAAACTCACTTTGGTT

17、TTTTCCAATTGTGATGTTTGGATTGTTGGGGGCTGCTG 480 | Sbjct 421 AATTCTCAAACTCACTTTGGTTTTTTCCAATTGTGATGTTTGGATTGTTGGGGGCTGCTG 480 Query 481 GCCTTGACAGGTCGGCTCCTCTTAAATGCATTAGCAGGACTTCTCATTGCCTCTGCGCAT 540 | Sbjct 481 GCCTTGACAGGTCGGCTCCTCTTAAATGCATTAGCAGGACTTCTCATTGCCTCTGCGCAT 540 Query 541 GATGTGATAATTATCACT

18、CATCAATAGCACGCATGAATAGAGTCCAGCTCTCTAATCGTC 600 | Sbjct 541 GATGTGATAATTATCACTCATCAATAGCACGCATGAATAGAGTCCAGCTCTCTAATCGTC 600 Query 601 CGCAAGGACAATTTGACAATTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGC 660 | Sbjct 601 CGCAAGGACAATTTGACAATTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGC 660 Query 661 ATATCAATAAGCGGAGG