实验五.血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳分离

1、1,血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳,2,电泳技术-电泳的基本概念和原理 一、概念：电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。 二、原理：在一定PH条件下，不同的物质具有不同的等电点就带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此，可使它们分离。 质点在电场中的移动方向决定于颗粒所带电荷的种类：带正电荷的颗粒向电场的负极移动；带负电荷的颗粒向正极移动；净电荷为零的颗粒在电场中不移动。 颗粒在电场中移动的速度主要决定于颗粒带电荷的量，同时受颗粒形状和颗粒相对分子质量的大小的影响。,3,在电场中，颗粒的移动速度，通常用泳动度（或迁移率）来表示。泳动度是带电颗粒

2、在单位电场强度下的泳动速度即： v d/t d L -=-=- E V/L V t 式中：泳动度（即迁移率），cm2 /（Vs）； v泳动速度，cm/s； E电场强度，V/cm； d颗粒泳动距离，cm； V实际电压，V（伏特）； t通电时间，s（秒）； L介质的有效长度（cm）。 通过测量d、L、V、t即可计算出颗粒的泳动度。 在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度，它是胶体颗粒的一个物质常数，可用其鉴定蛋白质等物质。,4,三、影响电泳泳动度的因素： 1、颗粒性质：颗粒的直径、形状及所带静电荷量对泳动速度有较大影响。一般来说颗粒带净电荷量越多，或其形状越接近球形，在电场中的泳动速度就

3、越快。反之则越慢。 2、电场强度：电场强度是指每一厘米的电位降。又称为电位梯度或电势梯度。它对泳动速度起着十分重要的作用。电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快。反之，则越慢。根据电场强度（电压的高低）大小，又可将电泳分为常压电泳（100500V）和高压电泳（50010000V）。前者电场强度为210伏特/厘米，后者为70200伏特/厘米。常压电泳多用于分离大分子物质。高压电泳常需要冷却装置。高压电泳时间短，有时仅需数分钟，多用于分离小分子物质。,5,3、溶液的性质：主要是指电极溶液（缓冲溶液）和蛋白质样品溶液的pH值、离子强度和粘度等。 （1）pH值：溶液pH值决定带电颗粒的解离程度，也即决定

4、其带净电荷的量。对蛋白质而言，溶液的pH值离其等电点越远，则其带净电荷量就越多，从而泳动速度就越快。反之，则越慢。当pH值等于其PI时，净电荷为0，也为0。因此电泳时应选择适宜的PH值，并需采用缓冲溶液，使溶液的pH值恒定。 （2）离子强度：溶液的离子强度一般在0.020.2之间时，电泳较合适。若离子强度过高，则会降低颗粒的泳动速度。其原因是，带电颗粒能把溶液中与其电荷相反的离子吸引在自己周围形成离子扩散层。若离子强度过低，则缓冲能力差，往往会因溶液PH值变化而影响泳动的速率。,6,离子强度的计算公式为： I1/2mizi2=1/2(m1z12+m2z22+mnzn2) I溶液的离子强度； m

5、i离子的摩尔浓度； zi离子的价数 1，2，n代表各种离子。 （3）溶液粘度： 泳动度与溶液粘度是成反比关系。因此，粘度过大或过小，必然影响泳动度。 4、电渗：当支持物不是绝对惰性物质时，常常会有一些离子基团如羧基、磺酸基、羟基等吸附溶液中的正离子，使靠近支持物的溶液相对带电。在电场作用下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物的离子基团吸附溶液中的负离子，则溶液层会向正极移动。这种溶液层的泳动现象称为电渗。,7,因此，当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，则加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。 A B / / + + + A支持物 B支持物,8,5、焦耳热：

6、在电泳过程中，电流强度与释放出热量（Q）之间的关系可列成如下公式： QI2Rt 式中R为电阻；t为电泳时间；I为电流强度。公式表明，电泳过程中释放出的热量与电流强度的平方成正比。当电场强度或电极缓冲液中离子强度增高时，电流强度会随着增大。这不仅降低分辨率，而且在严重时会烧断滤纸或熔化琼脂糖凝胶支持物。 6、分子筛（筛孔）：支持物琼脂和聚丙烯酰胺凝胶都有大小不等的筛孔-分子筛，在筛孔大的凝胶中溶质颗粒泳动速度快。反之，则泳动速度慢。 除上述影响泳动速度的因子外，温度和仪器装置等因子的影响也应考虑。,9,四、电泳的分类 目前，电泳（electrophoresis）方法大致可分为三类显微电泳、自由界

7、面电泳（没有支持物）及区带电泳。以区带电泳应用比较广泛。显微电泳是用显微镜直接观察细胞等大颗粒物质电泳行为的过程。目前已用于研究膜结构及癌细胞和正常细胞的差异性等方面。 自由界面电泳是被分离的溶质颗粒经电泳后与缓冲溶液之间形成界面的电泳过程。利用适当的光学系统可观察到界面的移动。在电泳过程中，每个移动界面（峰）相当于某一特定的蛋白质。如：用于血浆蛋白成分的电泳。,10,11,区带电泳（zone electrophoresis）是由于在支持物上电泳时各组分因迁移速度不同分布成区带而得名。区带电泳按其支持物性状（物理性状）不同可以分为四类： 1、滤纸和薄膜电泳：如醋酸薄膜电泳、聚酰胺薄膜电泳 2、

8、粉末电泳：支持介质是淀粉、纤维素粉、硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，铺成平板。 3、细丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳。此为微量电泳。 4、凝胶电泳：最常用的支持介质有：聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶，凝胶可制作成平板或柱子。,12,按仪器装置形式可分为： 1、平板电泳：将支持物质铺在平板上（玻璃或有机玻璃）进行电泳，此法最为常用。 2、垂直板电泳：将支持物铺在平板上，作垂直装置后进行电泳。 3、垂直柱形电泳：将支持物质装在垂直的圆形玻璃柱内进行电泳。 （圆盘电泳：将支持物质装入同一规格的玻璃管内，在一不连续系统中进行电泳，样品分离后的区带类似圆盘。）,13,血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳法分离实验目的:掌握

9、醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质 的原理和方法。,14,相关知识,血清蛋白,15,血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 一、原理： 采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120微米，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。 醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。已广泛应用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如：血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、球蛋白、糖蛋白等的分离和鉴定。

10、二、操作要点,16,（一）仪器与薄膜的准备： 1、醋酸纤维薄膜的润湿和选择： 将醋酸纤维薄膜条浸于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中，用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光泽面和无光泽面，并用铅笔在无光泽面上作记号。 2、制作“滤纸桥”。 （二）点样： 将此血清涂在薄载玻片的一端截面上，然后轻轻与距纤维薄膜一端2cm处接触，样品即呈一条带状渗透在纤维薄膜上。切不可用力过大把薄膜弄破。将薄膜平贴在滤纸桥上，点样端放在阴极，加盖密封平衡十分钟。 （三）电泳： 电压稳定在100120V，时间4560分钟，待电泳区带展开约33.5cm后关闭电源。,17,（四）染色： 电泳完毕后立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色510分钟。然后，用漂洗液浸洗，每10分钟左右换一次漂洗液，连续更换35次，至背景无色为止。染色完后将薄膜夹在干净的滤纸中，吸去多余的溶液。 （五）结果判断： 一般在染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白