第三章-蛋白质结构(3).ppt

1、,三、蛋白质的三级结构,1、定义 多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，沿三维空间多方向卷曲，进一步盘曲折叠形成特定的球状分子结构。 在三级结构中，具有极性侧链基团的AA残基几乎全部在分子的表面,而非极性残基则被埋于分子内部,不与水接确.而形成疏水的核心。,3、三级结构的特征： 含多种二级结构单元； 有明显的折叠层次； 是紧密的球状或椭球状实体； 分子表面有一空穴(活性部位)； 疏水侧链埋藏在分子内部， 亲水侧链暴露在分子表面。 实例：肌红蛋白,4、肌红蛋白的结构与功能,（1）肌红蛋白的功能：哺乳动物肌肉中储存氧并运输氧的蛋白。 （2）肌红蛋白的结构特点：1

2、963年，Kendrew a .一条多肽链，153个氨基酸残基，一个血红素辅基，分子量17600道尔顿。 b.肌红蛋白的整个分子具有外圆中空的不对称结构，肽链共折叠成8段长度不等的-螺旋体（A-H），最长的有23个氨基酸残基，最短的有7个氨基酸残基。拐弯处多由Pro、Ser、Ile、Thr等组成。 c.具有极性侧链的氨基酸残基分布于分子表面，而带非极性侧链的氨基酸残基多分布于分子内部，使肌红蛋白成为可溶性蛋白。,肌红蛋白,血红素辅基,抹香鲸肌红蛋白（Myoglobin）的三级结构,5、煤气中毒的机制,四、蛋白质的四级结构,四级结构是指由两 个或两个以上具有三级结构的多肽链按一定方式聚合而成的特

3、定构象的蛋白质分子。其中每条多肽链称为亚基。 通常亚基只有一条多肽链，但有的亚基由两条或多条多肽链组成，这些多肽链间多以二硫键相连亚基单独存在时无生物学活性。 一般来说具有四级结构的蛋白属于寡聚蛋白。,1.定义,2.维持蛋白质四级结构的主要作用力,在蛋白质四级结构中，亚基之间的作用力主要包括：氢键、离子键、范德华力和疏水键。即亚基之间主要是通过次级键彼此缔合在一起。 疏水键是最主要的作用力。,3.血红蛋白的结构与功能,（1）血红蛋白的结构特点： a.是四个亚基的寡聚蛋白，574个AA残基，分子量65000 b.是由相同的两条链和两条链组成四聚体22，成人的血红蛋白为22、胎儿的血红蛋白为22

4、c. 链由141AA残基组成， 链由146AA残基组成。 四条肽链的三级结构与肌红蛋白相似，各自内部有一个血红素辅基。 （2）血红蛋白的功能：存在于动物血液的红细胞中，具有运输O2和CO2的功能；血红蛋白还能和H+结合，从而可以维持体内pH.,血红蛋白四级结构,血红素辅基,一、蛋白质一级结构与功能的关系 1.同功蛋白质一级结构的种属差异性 细胞色素C是真核细胞线粒体内膜上一种含Fe的蛋白质，在生物氧化中起传递电子的作用。通过植物、动物和微生物等数百种生物的细胞色素C一级结构的研究表明： （1）亲缘关系越近，AA顺序的同源性越大。 （2）尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色素C功能密切相关

5、的AA顺序却有共同之处，即保守顺序不变,第五节 蛋白质的分子结构与功能,不同生物与人的细胞色素C相比较AA差异数目 黑猩猩 0 鸡、火鸡 13 牛猪羊 10 海龟 15 狗驴 11 小麦 35 粗糙链孢霉43 酵母菌 44,生物 与人不同的AA数目 黑猩猩 0 恒河猴 1 兔 9 袋鼠 10 牛、猪、羊、狗 11 马 12 鸡、火鸡 13 响尾蛇 14 海龟 15 金枪鱼 21 角饺 23 小蝇 25 蛾 31 小麦 35 粗早链孢霉 43 酵母 44,不同生物与人的Cytc的AA差异数目,圆圈代表分歧点,2.蛋白质一级结构的变异与分子病 分子病指蛋白质分子中由于AA排列顺序与正常蛋白质不同而

6、发生的一种遗传病(基因突变造成的)。 镰刀形贫血病： 病因：血红蛋白AA顺序的细微变化,-链N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患 者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys,镰刀形贫血病：病人体内血红蛋白的含量乃至红细胞的量都较正常人少，且红细胞的形状为新月形，即镰刀状。此种细胞壁薄，而且脆性大，极易涨破而发生溶血；再者，发生镰变的细胞粘滞加大，易栓塞血管；由于流速较慢，输氧机能降低，使脏器官供血出现障碍，从而引起头昏、胸闷而导致死亡。,正常红细胞,镰刀形红

7、细胞,正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图,谷氨酸在生理pH值下为带负电荷R基氨基酸，而缬氨酸却是一种非极性R基氨基酸，就使得HbS分子表面的荷电性发生改变，引起等电点改变，溶解度降低，使之不正常地聚集成纤维状血红蛋白，致使红细胞变形成镰刀状,输氧功能下降,细胞脆弱易溶血.,镰刀型贫血病,二、蛋白质的高级结构与功能的关系,如肌红蛋白与氧的结合,有些蛋白质分子在表现其生物功能时，构象必须发生一定的变化,一、两性解离性质及等电点 二、蛋白质胶体性质 三、蛋白质的沉淀 四、蛋白质的变性与复性 五、蛋白质的紫外吸收特性 六、蛋白质呈色反应,第六节蛋白质的重要性质,一、蛋白质的两性离解和等电点,蛋白质的

8、等电点：当溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳带电粒子在电场中移动的现象。,电泳,蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。 利用蛋白质的电泳现象，可以将不同带电性质和不同大小、形状的蛋白质分子进行分离纯化。 根据蛋白质净电荷的差异来分离蛋白质的一种方法是电泳法。,

9、如：NH3、COO 、OH、-SH、-CONH-等，它们都具有高度的亲水性，当与水接确时，极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形成一层水化膜，将颗粒彼此隔开，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。,二.蛋白质胶体性质,由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直径1-100nm之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围的大小，因而具有胶体溶液的通性。 蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因： 、蛋白质多肽链上含有许多极性基团。 2、蛋白质是两性电解质，在非等电状态时，相同蛋白质颗粒带有同性电荷，与周围的反离子构成稳定的双电层。使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致互相凝聚而沉淀。 蛋白质溶液由于具有水化层与双电层两方面

10、的稳定因素，所以作为胶体系统是相对稳定的。,蛋白质胶体性质的应用,由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法 半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等,三.蛋白质的沉淀,蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。 定义：蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀

11、作用。,（一）可逆沉淀,定义：在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,1.盐析 在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。 而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。 盐析的机理： 破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。

12、盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。,各种蛋白质的亲水性及荷电性均有差别，因此不同蛋白质所需中性盐浓度也有不同，只要调节中性盐浓度，就可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分散沉淀析出，这种方法称为分段盐析。,2.弱酸或弱碱沉淀法(等电点沉淀） 用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电点处，使蛋白质沉淀。 弱酸或弱碱沉淀法机理： 破坏蛋白质表面净电荷。,酸,酸,碱,碱,碱,酸,溶液中蛋白质的聚沉,3.有机溶剂沉淀法： 在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。 有机溶剂沉淀法的机理： 破坏蛋白质的水化膜。 注意：有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下

13、进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。,（二）不可逆沉淀,定义：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀（影响电荷）、重金属盐沉淀（Hg2+、 Pb2+ 、Cu2+、 Ag2+）和生物碱试剂或某些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀。,4.重金属盐沉淀(条件：pH 稍大于pI为宜) 当pH 稍大于pI时，蛋白质颗粒带负电荷这样就容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。 重金属沉淀法的机理： 重金属盐加入之后

14、，与带负电的羧基结合。,5.加热变性沉淀法 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐促进蛋白质加热凝固。 当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速. 如：煮鸡蛋 酶的制备：超氧化物歧化酶的提取,四、蛋白质的变性与复性 A、蛋白质的变性定义 天然蛋白质因受物理、化学因素的影响，使蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化。但一级结构未遭破坏，这种现象称为蛋白质的变性。,B、引起蛋白质变性的主要因素：,1.物理因素： 加热、高压、紫外线照射、X-射线、超声波、剧烈振荡和搅拌等 2.化学因素： 强酸、强碱、脲、去污剂（十二烷基硫酸钠（SDS）、重金属盐、

15、三氯醋酸、浓乙醇等。,C、蛋白质的变性后的表现,生物活性丧失；溶解度降低，对于球状蛋白粘度增加；光吸收系数增大；生物化学性质改变。 组分和分子量不变。,D、蛋白质变性的本质： 分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有序的状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。 变性后的蛋白质在结构上虽有改变，但组成成分和相对分子质量不变。,E、蛋白质的复性,定义：如果引起变性的因素比较温和，蛋白质构象仅仅是有些松散时，当除去变性因素后，可根据热力学原理缓慢地重新自发折叠恢复原来的构象，这种现象称作复性。,核糖核酸酶变性与复性作用,天然状态，有催化活性,非折叠状态，无活性,变性,天然状态 S-S-键恢复 而且是正确配对,蛋白质在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。,五、蛋白质的紫外吸收,六