分光光度法测定DNA的浓度和纯度

1、分光光度法测定dna浓度和纯度目的要求:理解：分光光度法测定脱氧核糖核酸浓度和纯度的原理；硕士：分光光度法测定dna浓度和纯度的技术方法；熟悉：分光光度法测定dna浓度和纯度的实验操作步骤和注意事项。实验原理:提取的dna的浓度和纯度是未知的，并且在随后的实验中需要一定的浓度和纯度要求，例如dna消化、连接和转化，因此有必要测量dna的浓度和纯度。脱氧核糖核酸的测定方法通常如下：紫外分光光度法；琼脂糖凝胶电泳(也称为荧光分光光度法)(1)紫外分光光度法：dna的所有碱基都具有一定的紫外吸收特性，最大吸收值在250-270nm之间。腺嘌呤的最大紫外吸收值为260.5纳米，胞嘧啶为267纳米，鸟嘌

2、呤为276纳米，胸腺嘧啶为264.5纳米，尿嘧啶为259纳米。这些碱基与戊糖和磷酸形成核苷酸后，最大吸收峰不变，但核酸的最大吸收波长为260纳米，吸收波谷为230纳米。这种物理性质为确定核酸溶液的浓度提供了基础。在波长为260纳米的紫外线下，10od的光密度相当于50 g/ml的双链dna浓度；单链脱氧核糖核酸或核糖核酸的量为40微克/毫升。单链寡核苷酸的量为20微克/毫升。它可以用来计算核酸样品的浓度。分光光度法不仅可以测定核酸的浓度，还可以通过测量260纳米和280纳米的紫外吸收值之比来估计核酸的纯度(a260/a280)。脱氧核糖核酸的比例是1.8，核糖核酸的比例是2.0。如果脱氧核糖核

3、酸比率高于1.8，制剂中的核糖核酸没有被消除。在核糖核酸和脱氧核糖核酸溶液中，酚和蛋白质的比例会降低。在270纳米处高吸收的存在表明苯酚的干扰。当然，同时含有蛋白质和核糖核酸的脱氧核糖核酸溶液的比例是1.8，因此有必要结合凝胶电泳和其他方法来鉴定核糖核酸是否存在，或者用蛋白质测定的方法来检测蛋白质是否存在。紫外分光光度法仅用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液。(2)琼脂糖凝胶电泳(荧光分光光度法):对于非常稀的核酸溶液，可以使用琼脂糖凝胶电泳。溴化乙锭在紫外光的照射下能发出荧光，并被插入到dna分子中形成荧光共轭物，荧光共轭物使发出的荧光增强数倍，荧光强度与dna含量成正比。将已知浓度的

4、标准样品作为电泳对照，可以估计待测样品的浓度。只需要5-10克的脱氧核糖核酸，肉眼观察可以检测到0.05-0.1克的脱氧核糖核酸。该方法仅估计水平，还应考虑dna或核糖核酸样品中分子的大小和标准对照中核酸分子的长度。仪器和试剂:主要仪器：紫外分光光度计、应时杯、离心管和微量移液器；主要试剂：实验1提取的质粒样品和纯水。重要的实验步骤和教学设计:吸收5l dna样品或4l核糖核酸样品，加水至1毫升，混匀，转移至分光光度计的应时比色杯中。如果样品少，可以使用0.5毫升的试管，上述核酸样品和水的量可以减少一半。首先，用1毫升水将分光光度计校准到零点。分别在260纳米和280纳米读出光密度，用od260核酸稀释的dna样品浓度为50/1000倍；核酸样品稀释倍数为40/1000的核酸浓度od260浓度单位为微克/升.根据步骤1中的稀释方法，dna或核糖核酸的浓度(微克/升)是od260的10倍；如果od260为0.1，则样品的浓度为1微克/升脱氧核糖核酸或核糖核酸。这个稀释系数很容易计算。如果是一个脱氧核糖核酸样品，od260/od280的比值大于1.8，表明核糖核酸仍然存在，因此核糖核酸酶可以考虑处理样品；小于1.6，表明样品中有蛋白质或苯