2012 胡萝卜组织培养

1、植物的组织培养,第二节 胡萝卜的组织培养,预备任务,2人/组， 2组/1个无菌操作台。 每组取如下工具放于无菌操作台上先行灭菌 从306取培养皿、镊子； 从316室取1瓶无菌水和8瓶培养基； 带1个500 mL的烧杯，作废液缸；1个500 mL的烧杯装工业酒精100mL。 注意 放置物品时，先关灭紫外灯，放好后，关上门，再开启紫外灯； 托盘不能放到无菌操作台里，要带回来。,一、组织培养基本原理,全能性 植物体的每一个完整的细胞都拥有形成完整植株的全部遗传信息，在一定的条件下都具有产生一株完整个体的潜在能力。 去分化 去除外植体原有的分化性状，重新进入新的发育分化状态。,二、组织培养的方法和步骤

2、,选择原则： 根据培养目的、易于诱导、带菌少。 生理状态：幼嫩的组织 取材季节：易成活，生长旺盛 植物的长势：生长健壮的组织 外植体大小：应根据培养目的而定 胚胎培养或脱除病毒，则外植体宜小； 快速繁殖，外植体宜大。 一般外植体大小在0.51.0cm为宜。,1、培养材料的采集,2、外植体的表面消毒处理,外植体的表面清洗：洗衣粉清洗，吐温。 外植体表面灭菌（一般采用2次灭菌法） 先用70%酒精浸1030s； 转到其它消毒溶液，灭菌液要充分浸没材料。 无菌水涮洗 涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右。,3、制备外植体与接种,将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊子等，在无菌的环

3、境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。在操作中严禁用手接触材料。 在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种24个，防止交叉污染。 接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。,三、无菌操作步骤,接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开紫外线灯进行杀菌； 接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯； 接种员洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，换穿拖鞋等； 上工作台后，用酒精棉球搽拭双手（特别是指甲处）和工作台面； 用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干； 接种时，接种员双手不能

4、离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等； 接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。,四、本实验胡萝卜的接种培养,2人/组，8瓶/组，留2瓶下次用； 把胡萝卜切成约4cm的段，怎么切呢？ 去除表皮，去除木质部和髓； 切成约402010 mm的条状，共切4块。,1、胡萝卜的切块处理,把切好的材料，放在100 mL的烧杯里，加入75酒精（现配100mL ），浸泡30秒； 然后将外植体转入0.2升汞中（250mL烧杯装100mL升汞），浸泡2530分钟； 把带有升汞的烧杯拿到超净工作台，取出材料，放入培养皿，用无菌水洗45分钟，重复3次。,2、消毒和清洗,

5、把洗净的材料用烧过的镊子夹到盛有滤纸的培养皿里，去除表面一层，然后切成约885 mm的块； 把切好的材料，用烧过的镊子夹到锥形瓶里，23块/瓶，包好封口膜和牛皮纸； 将培养基放回316原位，在2328恒温避光条件下培养。,3、接种与培养,五、注意事项,防火 实验中要常用酒精消毒、用酒精灯烧镊子、刀具，注意安全；手上涂酒精，要干后才能接近火源。 无菌操作 材料经升汞消毒后，还需严格进行无菌操作；为防止染菌，手要用酒精擦干净，镊子和刀经常在火焰上烧，锥形瓶、手不要放在盛材料的培养皿上方。 废液处理 实验完后，75%酒精和工业酒精，均应倒回到工业酒精的罐中 ；升汞有剧毒，小心不要溅出，废液倒回原处；

6、酒精和升汞千万别搞混。,六、常见错误举例,材料切得过小。 材料消毒时间过长。 切材料时下面没垫滤纸。 镊子、刀在酒精灯上烧过立即放到盛酒精的烧杯里。 操作时，手、三角烧瓶在盛材料的培养皿上方活动，容易把菌带到材料上。 把接种的切块压入培养基里面。 接种时瓶口垂直向上，手、镊子上的脏物掉到瓶里。 升汞回收倒入酒精桶里。,七、课后作业及预习,课后作业 有几种常用的外植体消毒液？主要原理是什么？效果如何？ 预习 根癌农杆菌转化的原理及方法。,材料处理 1）配75%酒精，倒升汞； 2）把胡萝卜切成约4cm的段； 3）去除表皮、木质部和髓，切成约402010 mm方块，4条。 消毒和清洗 4）把切好的材料，放在100 mL的烧杯里，加入75酒精，浸 泡30秒； 5）然后将外植体转入0.2升汞中，浸泡2530分钟，不能超 过30分钟； 6）把带有升汞和组织材料的烧杯拿到超净工作台，取出材料， 放入培养皿，用灭菌水洗45分钟，重复3次，用滤纸吸干。 接种与培养 7）把洗净的材料用烧过的镊子夹