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1、a,1,Sephadex系统知识,a,2,葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶系列是当今生物大分子分离、提取、纯化的重要分离材料， 按性能分包括 凝胶过滤、 离子交换、 疏水层析、 亲和层析，,a,3,主要用于蛋白质、核酸、多肽、多糖、酶的脱盐与分离纯化中。 葡聚糖凝胶为葡聚糖和环氧氯丙烷交联而成的珠状产品，化学性能稳定，在潮湿、中型ph、高压120度，灭菌30min情况下，不影响色谱性能，适用于柱色谱操作。用于蛋白质脱盐及不同分子量蛋白在凝胶分离范围内的分离纯化，可在酶、多糖、核酸和其它生物大分子的纯化中广泛应用。,a,4,葡聚糖凝胶G分子筛：,葡聚糖凝胶G-100/交联葡聚糖凝胶G-100/Sephad

2、ex G-100 分离：肽及球形蛋白质：4000150000；葡聚糖（线性分子）：1000100000 葡聚糖凝胶G-150/交联葡聚糖凝胶G-150/Sephadex G-150 分离：肽及球形蛋白质：5000400000；葡聚糖（线性分子）：1000150000 葡聚糖凝胶G-200/交联葡聚糖凝胶G-200/Sephadex G-200 分离：肽及球形蛋白质：5000800000；葡聚糖（线性分子）：1000200000,a,5,葡聚糖凝胶LH,用途：分离水不溶物质。 葡聚糖凝胶LH-20/Sephadex LH-20 分离中等大小生物分子，球蛋白分离范围1004000 葡聚糖凝胶LH-

3、60/Sephadex LH-60 分离10020000,a,6,葡聚糖凝胶C阳离子交换剂，吸附碱性蛋白：,羧甲基葡聚糖凝胶C-25/CM葡聚糖凝胶C-25/CM Sephades C-25 应用：MW20000；载量4-5mmol/g 羧甲基葡聚凝胶C-50/CM葡聚糖凝胶C-50/CM Sephades C-50 应用：中等大小生物分子（30200KD）；载量4-5mmol/g SP葡聚糖凝胶C-25/SP Sephades C-25 应用：MW200 KD；载量：2.0-2.6mmol/g SP葡聚糖凝胶C-50/SP Sephades C-50 应用：中等大小生物分子（30200KD）

4、；载量：2.0-2.6mmol/g,a,7,葡聚糖凝胶QAE-A阴离子交换剂，吸附酸性蛋白：,葡聚糖凝胶QAE-A25/QAE Sephades A-25 应用：MW200 KD；载量2.6-3.4mmol/g 葡聚糖凝胶QAE-A50/QAE Sephades A-50 应用：中等大小生物分子（30-200KD）；载量2.6-3.4mmol/g DEAE葡聚糖凝胶A-25/DEAE SephadexA-25 应用：MW200 KD；载量3-4mmol/g DEAE葡聚糖凝胶A-50/DEAE Sephadex A-50 应用：中等大小生物分子（30-200KD）；载量3-4mmol/g,a,

5、8,DEAE-Sephadex A-50提取法纯化多克隆抗体,DEAE-Sephadex A-50（简称A-50）为弱碱性阴离子交换剂，经过NaOH处理将Cl-型转为OH-型后，可吸附酸性蛋白。1球蛋白属中性蛋白，等电点为pH6.857.5，其余均属酸性蛋白。在溶液为pH8.0时，酸性蛋白均被A-50 吸附。从而可分离纯化IgG。,a,9,1. 批量吸附法,此法可在1天内完成提取过程，纯化前后样品体积变化不大，所得IgG无变性现象，抗体效价亦无明显降低。制品可达PAGE及免疫电泳纯。适用于提纯人、羊、兔等血清中的IgG。,a,10,【材料和试剂】,（1）DEAE-Sephadex A-50。（

6、2）PB缓冲液：0.01mol/L， pH6.5 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。,a,11,【操作步骤】,（1）A-50的预处理：称取46g A-50悬浮于5001000ml蒸馏水中，1h后倾去上层细粒。然后将A-50浸泡于0.5mol/L NaOH液（60100ml）中，搅拌后静置30min，以蒸馏水洗至中性，再用0.1mol/L NaH2PO4同上操作过程处理，蒸馏水洗至中性。最后用0.01mol/L，pH6.5 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（PB）平衡，减压抽干，保存备用。,a,12,（2）吸附提取：取15ml血清加等量0.01mol/L，pH6.5 PB稀释至30ml（

7、也可不稀释），加入1/4体积滤干的DEAE-Sephadex A-50（相当于干重1g）混合。室温（或4）浸泡1 h后过滤，收集滤液。再加入同样体积的DEAE-Sephadex A-50重复上述处理过程共3次，亦可在血清内加入过量DEAE-Sephadex A-50吸附处理一次。收集滤液合并，即为提纯的IgG制品。或再透析去盐，浓缩、冻干保存备用。,a,13,2A-50柱层析法,【材料和试剂】（1）DEAE-Sephadex A-50。（2）待纯化标本：杂交瘤腹水或培养上清，免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。（3）1.550cm 层析柱；透析袋及其他透析和层析所需的试剂和器材。（4）PB缓冲液：0.1mol/L，pH7.4 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。,a,14,【操作步骤】,（1）A-50经酸碱处理，平衡至中性后，浸泡于0.1mol/L，pH7.4 PB中，置4冰箱储存备用。（2）装柱：同DE52。（3）平衡：松开出水口螺旋夹，以PB平衡，控制流速为15滴/min，待洗脱液与流出液之pH值达到一致时，停止平衡。（4）加样、洗脱、收集与浓缩：基本上