血清蛋白质醋酸纤

1、1,血清蛋白质醋酸纤 维素薄膜电泳,2010-10-26 汪昭旋 黎小龙 李刚奇 赵亚军,2,实验目的：,掌握电泳的基本原理，了解电泳仪电泳槽的基本结构与功能。 熟悉电泳的基本过程与定量方法。 熟悉血清电泳在临床诊断中的作用。,3,1、电泳（electrophoresis）法 带点粒子在直流电场中向着相反电极移动的现象称为电泳。,4,电泳原理：在一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离。 影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象 影响电泳迁移率

2、的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状,5,常见的电泳技术：,1.醋酸纤维膜电泳 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.琼脂糖凝胶电泳 4.等电聚焦电泳 5.双向电泳,6,采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。 醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为0.10.15mm,7,8,优点：,1.吸附作用小 2.电渗作用小 3. 需加样量少 4. 亲水性小,9,实验原理：血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点以及形状也有差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋

3、酸纤维薄膜上分离成A、1、2、和五条区带。,10,三、实验器材,1. 电泳仪：为电泳提供直流电源。 2. 电泳槽：为电泳提供场所。多用有机玻璃制成，电极用铂丝。 3. 血清加样器 ：可用盖玻片或X胶片或微量加样器。 4. 醋酸纤维素薄膜：2cm8cm 5. 其它： 培养皿（直径9-10cm）、滤纸、玻璃板、镊子等。,DYY-5型稳压 稳流电泳仪,DYY-型 电泳槽,11,实验试剂,巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6、I=0.06) 氨基黑10B染色液：氨基黑10B 0.25g，用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解（可重复使用）。 漂洗液：甲醇45ml、冰醋酸5ml和蒸馏水50ml，混

4、匀。,12,实验操作流程,薄膜的准备 电泳槽的准备 点样 电泳 染色与漂洗脱色,13,操作步骤：,准备：将巴比妥缓冲液加入电泳槽的电极 室内，使正负极室的液面等高，电泳支架宽度正好适合醋纤薄膜的长度，用四层纱布或滤纸做盐桥，一端浸入缓冲液中，一端搭在支架上。 膜的预处理：将薄膜切成28cm，先于膜条无光泽面距一端1.5cm处用铅笔轻划一直线(点样线)，再将薄膜无光泽面向下浸泡于巴比妥缓冲液中，浸透为止（30min)。取充分浸透的膜条，将薄膜无光泽面向上，滤纸吸取多余的缓冲液，不要吸太干。,14,3. 加样：用滴管吸取待测血清一滴于玻璃片上，用点样器末端处蘸取少许样品，垂直轻印（迅速均匀）到薄膜

5、点样线上，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。 此步是实验的关键：以印章法加样时，动作应 轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。点样前可先在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样。,15,4.平衡：待血清渗入薄膜后，将膜条无光泽面向下置于电泳槽支架上，点样端靠近负极，薄膜两端要紧贴滤纸（点样线不要压在滤纸上），中间平直悬空，加盖密封，平衡5分钟。 5. 电泳：将电泳槽正负极分别与电源正负极接好。开启电源，调节电流密度为0.5mA/cm，如有10条宽2cm的膜条，其总宽度为20cm，应使用电流强度为20cm0.5mA/cm10mA。电压15V/

6、cm。通电50分钟左右，关闭电源。 6. 染色和漂洗：取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中，染色5分钟后取出，先用自来水漂洗1-2次，然后用漂洗液漂洗34次，至背景完全无色为止。,16,7.定量 （1）洗脱比色：将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0.4mol/l NaOH 4ml,于37水浴20分钟（不时振荡），待颜色脱净即用波长620nm比色，以空白管调零读取各管吸光度。 （2）计算: 吸光度总和（T） =A+1+2+（吸光度）,17,血清蛋白组分的相对百分数： A%=A/T100% T吸光度总和 1%=1/T100% 2%=2/T10

7、0% %=/T100% %=/T100%,18,(1)醋酸纤维素薄膜的预处理 市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。为防止指纹污染，取膜时应戴指套或用夹子。所选薄膜应厚薄均匀，否则应弃去不用，以免造成电泳区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。 由于薄膜吸水性比纸小，浸泡30 min以上是保证膜片上有一定量缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结构，最好让薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上聚集的小泡赶走。 点样时薄膜上的缓冲液不宜太多，但也不能太干。,注意事项:,19,(2)缓冲液的选择 本实验常用的pH86巴比妥缓冲液，其浓度为0.05O.09 mol

8、L。 选用何种浓度与样品及薄膜的厚薄有关。 缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽； 缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。,20,(3)加样量 加样品量的多少与电泳条件、样品性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。 作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量越少，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至相互干扰，染色也较费时。,3. 点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。,21,注意事项 市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若

9、飘浮于液面的薄膜在1530 s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳 醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥巴比妥钠缓冲液，其浓度为0.050.09 mol/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨 点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果 点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果 电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.40.6mA/cm膜宽度。电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散 操作过程为防止指纹污染，应戴手套,22,临床意义：,血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳，通常可分离白蛋白(Alb)、1、2、和-球蛋白五个组分，正常人血清中各种蛋白质浓度的差别较大，所以在许多疾病时仅表现出轻微变化，往往没有特异的临床诊断价值。 分析几种疾病的电泳分析结果，可以看出较显著的变化。,23,典型异常血清蛋白电泳图谱,在异常电泳图谱中，肾病综合征、肝硬化和多