第六章-免疫学食品检测技术及其进展.pptx

1、,曹林,南京农业大学食品科技学院,免疫技术在食品分析、检验、检疫,上的应用,第七章,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only., 概述, 免疫检测技术, 案例分析, 免疫检测新技术和趋势,食品免疫检测技术及其进展,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,食品行业产业大, 谷类、肉类、蔬菜、水果、饮料 2007年，中国肉类生产增加值初 步核算约为1万亿元，肉品加工销 售收入2701亿元。,食品行业总产值6万亿元，相

2、当于4倍汽车产业!,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,瘦肉精 苏丹红,素 孔雀 石绿,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only. 食品安全的几个热点问题 氯霉, 生物危害 人畜共患病 食品源性致病菌 微生物, 化学危害 药残 激素 有害生成物,添加剂 危害存在于原料、加工过程、储运,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation on

3、ly. 食品质量安全,第二节、免疫检测技术,ELISA,侧向流动试纸条,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,免疫检测技术,1.酶联免疫吸附法（ELISA）,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定,方法中有三个必要的试剂：,（1）固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂（immunosorbent）；,（2）酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate）；,（3）酶反应的底物。,最常见的检测方法是夹心法,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Softw

4、are For evaluation only.,免疫检测技术,基本原理,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,加样 温育 洗涤 显色,加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在 孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 抗原抗体完成反应的保温过程，应注意温育的温度和 时间应按规定力求准确。 清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸 附的干扰物质。洗涤是最主要的关键技术。 显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。 反应的温度和时间仍是影响显色的因素。,Generated by Fo

5、xit PDF Creator Foxit Software For evaluation only. 免疫检测技术,定量测定,免疫检测技术,ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体 的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批 测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制 作标准曲线。,测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较 宽，曲线最高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数纸， 以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的 值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平 坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。,Gener

6、ated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,根据转基因标准物质绘 制的标准曲线,根据外源蛋白标准绘制,的标准曲线,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,96微孔板,用于RR大豆 和Bt 玉米ELISA检测,Agdia转基因产品内毒素蛋白,检测试剂盒,免疫检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,2.侧向流动型免疫试纸条方

7、法（Lateral Flow strips）,根据抗原抗体特异性结合的原理工作。,硝化纤维代替聚苯乙烯反应板为固相载体。,免疫检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,2 1. Tests for CryI(Ab) & CP4 EPSPS 2. Plant & seeds 3. More coming soon,3,1 1. Punch leaf disc 2. Add buffer and grind in tube 3. Insert flow strips for testing,Gen

8、erated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only. 免疫检测技术 Lateral Flow Strip Protocol,免疫检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,Canola - +,Cotton - +,Soybean - +,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only. 免疫检测技术 Lateral Flow Strip

9、检测应用,目前应用方法的比较,免疫检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,特异性与灵敏度, 只能在含有靶序列的转基因产品中检测出阳性信号!,需要测试不同植物品种,需要测试不同的转基因植物, 足够低的检测灵敏度，满足转基因标识的要求, 检测极限（LOD） 定量极限（LOQ）,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,正 确 度,高精度,但是远离真实值,Generated by Foxit PDF Cre

10、ator Foxit Software For evaluation only.,接近真实值,但是精度较低,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,接近真实值,高精度,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,重,复,性,在实验室内部不同 重复下的精度,同样的方法,r,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only., 重复条件

11、下的精度 同样的方法 不同实验室, 国际间的实验室、国内不同 实验室,R,重,复,性,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,四、转基因产品检测新技术和趋势,芯片检测技术 复合PCR技术 等温扩增技术 传感器技术 光谱学技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,简单的概括就是将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，,与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品 中靶分子的

12、数量和序列信息。 基因芯片的基本原理？,基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法(southern、northern)一致， 应用已知的核酸序列作为探针与互补的靶序列杂交，通过随后的信号检测进 行定性与定量分析。,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only. 基因芯片检测技术 什么是基因芯片技术？,Southern & Northern,杂交,斑点杂交,宏芯片Macroarray,微芯片Microarray,基因芯片检测技术 基因芯片发展历史,Generated by Foxit PDF Creator

13、Foxit Software For evaluation only.,低密度芯片,探针数量一般在几十或者几百个之间。主要用于少数 目的基因和序列检测及确认。根据已知的靶序列设计针对 性的探针。,高密度芯片,探针数量可以达到几千甚至数万。主要用于大规模的 基因检测、筛选等。根据生物体全基因组的已知基因信息 甚至只根据序列信息设计探针。该芯片技术要求复杂，价 格昂贵。,基因芯片检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,(i)提取样品：裂解细胞，提取DNA（或者RNA）并纯化。,(iii) 杂交和

14、冲洗：按碱基配对原理DNA/cDNA样品与芯 片探针进行杂交，然后对芯片进行清洗。非特异性的结 合可以部分的冲洗掉。,(iv) 扫描和成像：用适当的方法使标记底物激发荧光或 者显色，扫描仪器记录每个样点的信号值，样点信号的 强度取决于杂交的样品DNA/cDNA的量。,(v) 数据处理与分析。读取芯片样点的信号值，对信号进 行标准化等处理，通过计算机分析得出结果。,工作流程,(ii)样品的扩增与标记：样品DNA/RNA通过PCR扩增、 反转录等技术扩增并掺入荧光标记分子或放射性同位素。,基因芯片检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software

15、For evaluation only., ,目前报道的基因芯片用于转基因检测的应用包括以下方面。 利用低密度芯片进行定性检测。 该方法是目前研究和应用最广泛的芯片检测方法，将针对特异序列设计的,探针用点样法点在芯片上。一张芯片可以检测几种甚至十几种转基因品系。 利用低密度芯片进行半定量或定量检测。,该方法基本原理与定性检测方法相同，不同的是采取特殊设计的样品扩增,方法，建立起DNA样品的起始量与扩增后样品荧光量的关系，通过检测芯片杂交 的信号强度确定起始样品量。 利用覆瓦式芯片检测未知的转基因样品。,目前仍在发展阶段。该方法利用转基因相关载体设计探针，使探针覆盖大,量的转化载体序列，从而达到

16、检测未知样品的目的。 下面对这三种应用分别举例说明。,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only. 基因芯片检测技术 基因芯片在转基因检测中的应用:,利用低密度芯片检测食品中转基因成分,Serge Leimanis. et al. Plant Molecular Biology (2006), 可以同时检测9种转基因品系、确定5种植物物种以及三种,转基因的筛选元件。, DNA样品在扩增时标记生物素，扩增产物直接与芯片杂交， 通过随后的显色步骤检测芯片杂交情况，确定样品中所含 的成分。,基因芯片检测技术,Ge

17、nerated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only., ,第一部分 品系特异性芯片-针对品系特异性的探针 第二部分 物种特异性芯片-针对内标基因的探针 第三部分 筛选特异性芯片-针对筛选元件的探针 第四部分 对照探针,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only. 基因芯片检测技术 芯片探针的设计,利用基因芯片定量检测转基因成分, 通过特殊设计的样品DNA扩增方法实现定量检测的目的。 芯片PCR技术,1、在芯片上固定反向引物作为探针

18、2、特异性靶标与引物退火结合 3、固定引物延伸,4、变性后正向引物退火延伸 5、特异性序列在芯片上扩增,基因芯片检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,利用Tiling芯片检测未知的转基因产品, 根据一系列的转化载体作为参考序列设计高密度的基因芯片，然后将全基因,组DNA直接与芯片杂交，以检测未知的转基因物种。, 设计25bp长度的探针对235个植物转化载体的双链序列(约2兆个碱基)进行覆,盖。通过筛选得到37257个探针。, 利用该芯片检测出了3种转化载体或者T-DNA序列未知的转基因拟南

19、芥和水稻,品系。, 该方法的灵敏度仅要求样品DNA中含有一段大于140bp的与参考序列匹配的,片段存在即可得到阳性结果。,Torstein Tengs et al BMC Biotechnology 2007, 7:91,基因芯片检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,图中粗黑线为部分检测结果，以及该序列在基因组上的位置。但 该结果表明此方法目前只能检测离散的转基因通用元件。,基因芯片检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For

20、 evaluation only.,基因芯片技术在转基因检测中的应用前景, 集成芯片，利用一块芯片可以检测目前商业化的转基因品,系。, 定量芯片，更加精确和高通量的定量检测芯片技术。 Tiling芯片，检测未知转基因样品并可对其分子特征进行,描述。, 高密度基因组芯片，研究转基因事件的非预期效应，包括 在基因组水平上的DNA的插入、缺失、扩增、位移等以及 转录组水平上基因表达的沉默、激活、上调、下调等。,基因芯片检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only., ,Multiplex-PCR (con

21、ventional PCR) Multiplex-PCR& CGE Multiplex-PCR& Microarray Multiplex-PCR& SYBR Green I,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only. 复合PCR检测技术 定义 是指在一个单一反应体系中加入一对以上的特异引物对，从 而同时扩增多个序列。 方法分类,Multiplex-PCR,传统复合定性PCR的方法,通过优化各个引物对之间的浓度比，达到同时特异性扩增的目的。,同时扩增8种转基因玉米的多重PCRHari k. et al,2

22、008,复合PCR检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,检测LOD可以达到0.25%，这种方法快速，灵敏，高特异性， 价格低廉，方便操作，可用于日常转基因产品的检测。,Hari k. et al,2008,复合PCR检测技术,Multiplex-PCR (conventional PCR),Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,Multiplex-PCR& CGE,多重PCR结合酶切分析-毛细管

23、电泳检测,基于多重PCR产物的扩增，其特异性引物在一 端都标记了6-FAM的荧光基团。,PCR产物通过特异性的内切酶进行酶切消化，从 而产生特异性的酶切片段。,酶切片段进行毛细管电泳（CGE)的荧光检测， 通过产生预期的荧光信号，从而确定转基因陈 分的存在,复合PCR检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,Multiplex-PCR& CGE-LIF,分析同时含有转基因玉米 MON863和GA21的混合样品,Virginia. et al, 2008,这种方法可以同时检测多个目 的片段，高通

24、量，高灵敏度。 唯一的缺点在于设备比较昂贵。,复合PCR检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,Sidney et al, 2008,复合PCR检测技术,同时检测12个靶序列,Multiplex-PCR& Microarray,多重PCR结合基因芯片技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,Multiplex-PCR& Microarray,Sidney et al, 2008,复合PCR检测技

25、术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,Multiplex-PCR& Microarray,Sidney et al, 2008,这种方法也是 高效的，并且 高通量。唯一 不足在于所需 仪器设备比较 昂贵。,复合PCR检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,根据PCR产物Tm值不同对多重PCR产物进行检测！,复合PCR检测技术,Multiplex-PCR& SYBR Green I,Genera

26、ted by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,复合PCR检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,1445 413bpTm=95.24 531 351bp,用染料 ava green，对1445, 531, 88913, 15985, sad I PCR 产物进行熔解曲线分析,Tm=88.0,88913 231bp Tm=79.2 15985 175bp Tm=78.1,Sad I 107bp Tm=83.6,复合PC

27、R检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,15985 175bp 78.1,88913 231bp 79.2 Sad I 107bp 83.6,531 346bp 86.0 1445 413bp 95.4,复合PCR检测技术,这种方法对于仪,器要求相对较低、 操作简单、实验 时间短，但是不 能检测太多的目 的靶序列！,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,B3,F3,F2 FIP,F1C,B3,B

28、2,B1,F1C F2C F3C,B3C,B2C,B1C,F1,F2,F3,BIP B2,B1C,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only. 等温扩增技术 LAMP （loop-mediated isothermal amplification ） LAMP即环介导等温PCR，是由Notomi T等在2000年发明 的一种新颖的恒温核酸扩增方法 LAMP的基本原理是针对靶基因的6个区域，设计4条特异 性引物，利用一种链置换DNA聚合酶 在恒温65左右反 应1小时,第一阶段：茎环产生阶段,第二阶段：循环扩增

29、阶段,等温扩增技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,Lectin,Mon89788的3,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 RRS,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Mon89788的5,LaneM-11,M：mark ，1：空白，2：89788-3/5/RRS，3：MON810，4：GT73，5：,棉花 ，6 ：转基因番茄，7：非转大豆，8：烟草，9：花生，10：芝麻，11：荞麦,LaneM-12,M：m

30、ark ，1：空白，2：89788，3：RRS，4：MON810，5：GT73，6：,棉花， 7：转基因番茄，8：非转大豆，9：烟草，10：花生，11：芝麻，12：荞麦,M 1,2,3,4,5,6,7,8,9 10 11,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only. 等温扩增技术 特异性和灵敏度,LAMP的优点,1 操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需,用水浴锅就可完成反应,2 高特异性：LAMP由4条引物扩增靶序列的6个区段,3 快速、高效：整个扩增30分钟即可完成,4 灵敏度高：扩增模可仅为

31、1拷贝,等温扩增技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only., 目前LAMP技术广泛应 用于细菌、病毒的检测 中, LAMP技术在转基因检,测中应有极少,等温扩增技术 LAMP技术应用,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,等温扩增技术,Nucleic Acid Sequence-Based,Amplification (NASBA),Generated by Foxit PDF Creator Foxit

32、 Software For evaluation only.,WP5 & & meeting 11-12 May Ljubljana,ssRNA/ss cDNA,Reverse Transcription,T7-specific primer RNAse H activity,Transcription,T7-RNApolymerase promoter sequence + specific sequence,Second target specific sequence,5,RNA,3,c DNA (-),Reverse Transcription,5,ds cDNA,5 3,RNA po

33、l,Primer extension Primer extension,3 5 second specific primer,3 5,ss DNA,5 5,3,RNA (-) 100-1000 copies,3,3,3,3,3,3,3,3,3,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only. NASBA principle 3,转基因产品检测中应用, High amplification (,singleplex),tNOS, Mon810,1.106in,Amplicons,tested,Samples,35

34、S,IVR,tNOS,GA21 +* + + qualitative and quantitative detection: IVR, 35S,RRS + + -,EH92potato,- - +,G004/07 (soy skins) +,G090/09 (negative oilseed rape) - - -, Specificity successfully assayed on +* + wild-type maize, Mon810, Mon863 and GA21 maize, RRSoya, EH592-527-1 potato and food and feed G033/0

35、7 (feed, only IVR) - + -,Mon810 DNA,+ +,-,Mon863 DNA 25 min amplification sufficient,+ +,+,* - a trace was detected presence confirmed with quantitative PCR 55,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,Quantitative aspects, Linear amplification in a short time (5 to 25 min)

36、Assessment of the sensitivity and linearity of,amplification (serial dilution), Good sensitivity (absLOD between 2 and 11 copies), Broad linear range ( 3 log10),Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,Ct, Same linear range as for singleplex (3 log10) Same sensitivity as fo

37、r singleplex (down to 2 copies) Same amplification profile as for singleplex 10.00 5.00 0.00,15.00,20.00,25.00,1,10,100,1000,10000,copynb,ctl tNOS IVR 35S tNOS IVR R2 = 0.9353 35S R2 = 0.9029 tNOS R2 = 0.9548,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only. Mon863 ctl IVR R2 = 0.98

38、68 ctl 35S R2 = 0.9984 ctl tNOS R2 = 0.9992 50.00 45.00 40.00 35.00 ctl IVR 30.00, NASBA操作简单，是一个恒温反应，反应温度为41C，不,需要热循环仪，, 同PCR相比，以RNA为模板，不受背景中DNA的干扰，,不易发生交叉污染。, 整个反应过程由三种酶控制，循环次数少，忠实性高，其,扩增效率高于PCR，特异性好。,优点：,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only., 广泛用于禽流感病毒、新城疫病毒、口 蹄疫病毒、狂犬病

39、病毒和产单核细胞李 斯特菌的检测和研究中, 国家发布这次发布的8 项禽流感系列标,准中,有两项应用了NASBA 检测方法,NASBA的应用,等温扩增技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,展望, 尽管PCR有着各种各样的优点，但在应用方面， 还有其自身的缺点：例如，循环中需要高精度的 温度循环，扩增抑制剂对灵敏度的影响等, 等温扩增技术高灵敏度、高特异性、操作简便，,不需要昂贵的仪器和试剂，花费时间少, 所有这些技术使快速、准确、简便、高效、低消,耗和适用面广的转基因检测技术成为可能。,等温扩增

40、技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,传感器(Biosensor),表面等离子共振式传感器(Optical,biosensors),压电式传感器(Piezoelectric biosensors),电化学式传感器(Electrochemical biosensors),传感器检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,表面等离子共振式传感器(Optical biosensors),原理：当入射光

41、以临界角入射到两 种不同折射率的介质界面时，可引起金 属自由电子的共振，使反射光在一定角 度内大大减弱。其中，使反射光在一定 角度内完全消失的入射角称为SPR角。 SPR随表面折射率的变化而变化，而折 射率的变化又和结合在金属表面的生物 分子质量成正比。因此可以通过获取生 物反应过程中SPR角的动态变化，得到 生物分子之间相互作用的特异性信号。,将目标DNA和固定在传感器表面,的探针杂交，使得溶液表面的折射率 改变，该折射率的改变和杂交的目标 DNA的质量成正比。,传感器检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluat

42、ion only.,不同长度探针的结果比较,从图中可以看到，13mers 和15mers的探针能够有效的和 目标序列杂交，相反，11mers 的探针效果偏低，且稳定性也 较低。 优点：灵敏度高 无需标记 实时监测,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only. 传感器检测技术,压电式传感器(Piezoelectric biosensors),压电晶体表面微小的压力变化会引,起其振动谐振频率的改变，依据这一原 理，可以通过测量其谐振频率的变化来 测定出晶体表面的压力变化。,传感器检测技术,Generated b

43、y Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,图中是传感器对转基因玉,米Bt176的一个检测，达到平衡 状态时，共振频率的变化（f） 为18Hz。,传感器检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,优点：,PCR产物无需标记,快速,成本低,图中显示的是由传感器分,析的不同百分含量的玉米标准 物质的一个结果，转基因的百 分含量和频率的变化值的线性 关系，显示了转基因的定量检 测。,传感器检测技术,Generated by Foxit

44、 PDF Creator Foxit Software For evaluation only.,电化学式传感器(Electrochemical biosensors),使用的电极：金电极、碳电极、玻,璃电极等,电化学方法:酶联免疫法、亚甲基蓝,反应法等,以酶联方法为例：生物素标记的PCR产物与固定在传 感器上的探针杂交，然后加入抗生物素蛋白链菌素和 碱性磷酸酶的复合物，碱性磷酸酶可以催化奈基水解 成有活性的奈酚，然后通过循环伏安法检测。,传感器检测技术,Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only., ,将巯基丙酸(MPA)自组装于金电极表面形成单分子膜，再利用1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 的活化作用将ssDNA探针序列固定于金电极表面。 将ssDNA修饰的电极与待测溶液中人工合成的转基因食品中常有的 根癌农杆菌终止子(NOS)基因片段进行杂交，在Fe(CN)6 3-/4- 溶液中进 行循环伏安，表征ssDNA固定及杂交过程