DNA测序 化学降解法PPT课件

1、.1，DNA序列分析，2，脱氧核糖，含氮碱，磷酸，A，G，C，T，DNA的基本单位，脱氧核苷酸，腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，胸腺嘧啶，胸腺嘧啶，4，成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。1977年，Maxam和Gilbert报道了如何通过化学分解来测定DNA序列。在同一时期，Sanger发明了荧光自动排序技术，这种技术在20世纪90年代初出现，旨在将DNA排序引入自动排序的时代。这些技术统称为第一代DNA测序技术。5，第二代排序技术，6，3代测序技术比较，第7、3代排序技术，第2代排序技术在准备排序库时由PCR放大，该PCR工艺可以引入突变，也可以改变样品中核酸分子的比例关系。另

2、外，第二代排序的读取长度大体较短，在数据分割时可能会出现问题。为了克服这种缺点，业界开发了以单分子实时排序和纳米孔为特征的第三代排序技术。8，Maxam-Gilbert DNA化学分解法，基本原则：直接或间接识别4种碱基，将碱基转换成特定的修饰碱基，妨碍磷酸在修饰碱基中的结合，使一个DNA片段的5段磷酸碱基成为放射性标记，以不同的化学方法修饰和分解特定碱基，一系列长度不同，末端5个的dnn将双链DNA样本在单链每一单链的相同方向上制成放射性同位素，DNA带分别用不同的方法处理，得到一个核苷酸的分解DNA群电泳，读取DNA的核苷酸序列。9，10，首先显示用限制性内切酶将DNA切成10200bp的

3、测序材料；这个片段用碱性磷酸化酶处理，去除5端磷酸。32P显示在5OH末端，用聚核苷酸磷酸激酶催化。标记碎片变为单个链。用特定的化学试剂徐璐作用于不同的碱基，进行修饰，然后利用哌啶甲酸，切割反应碱基的多个核苷酸链，再利用4个徐璐不同的特异反应，将末端显示的DNA分子切成不同长度的片段，形成两端都有特定碱基长度不同的DNA片段集合；电泳和放射性自我开发后，可以在4个反应系统中统一阅读，并直接读取正在测试的DNA的整个核苷酸序列。11、此反应的核心是DNA的4种核苷酸中的1-2种特定化学切割反应，即碱基的特定变形，修饰碱基从核糖环中转移。失去碱基的糖环部位发生了DNA链断裂。化学试剂对核苷酸进行化

4、学修饰，妨碍磷酸二甲酯结合，其中包括二甲基硫酸(dimethylsulphate)、肼(hydrazine)、哌嗪(Perry din)甲酸等。在碱性环境中，胞苷c和胸腺嘧啶t的C4和C6位置使肼键断裂。添加高浓度盐(1.5米NaCl)后，肼被细胞色素c破坏。在高温碱作用下(90，1.2M NaOH)，腺嘌呤a部位会发生严重的断裂反应，但对胞嘧啶c的反应很弱，哌啶甲酸(90，1mol/L)在受精部位两端破裂DNA的糖磷酸链，胞嘧啶，胸腺嘧啶，13，二甲基硫酸二甲酯，热哌啶：酸作用下嘌呤的糖苷水解导致DNA链在脱磷区(g和a)破裂。，14，DNA化学分解反应系统基本变形试剂基本链断裂试剂破裂点G

5、二甲基九非甲基六氢吡啶g a甲酸脱嘌呤作用六氢吡啶G A c肼开环六氢吡啶C和t肼(气盐)细胞素开环六氢吡啶C，二甲基硫酸(DMS)主要为中性甲酸有塔林的效果。DNA链在塔林区(g和a)破裂。肼。在碱性条件下作用于t胸腺嘧啶和c胞嘧啶，在具有六氢吡啶的状态下，在这个核苷酸位置发生DNA链断裂。在反应系统中添加高浓度盐会降低胸腺嘧啶反应率，主要起到细胞素的作用。A C肼90C，NaOH (1.2M)破坏反应，15，在四种反应体系中，用化学试剂特异性破坏DNA的机制是G A反应-(哌啶)甲酸在嘌呤环中对氮原子进行化学化，削弱嘌呤二核苷酸和腺嘌呤二氧核糖核苷酸的糖蛋白结合，然后取代嘌呤。g反应-硫酸

6、二甲酯(DMS)制造了GN7甲基化，取消了C8-C9之间的化学键，哌啶取代了改性鸟氨酸和核糖的结合。T C反应-肼分离嘧啶环，用哌啶取代碱片。c反应-如果NaCl存在，则只有c能与肼反应，之后修改的胞嘧啶将被哌啶取代。16，在四种反应体系中，化学试剂特异性地打破DNA的机制是G A反应-(哌啶)甲酸在嘌呤环中对氮原子进行化学化，削弱嘌呤脱氧核糖核苷和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸中的糖苷结合，然后哌啶取代嘌呤。g反应-硫酸二甲酯(DMS)制造了GN7甲基化，取消了C8-C9之间的化学键，哌啶取代了改性鸟氨酸和核糖的结合。T C反应-肼分离嘧啶环，用哌啶取代碱片。c反应-如果NaCl存在，则只有c能与肼反

7、应，之后修改的胞嘧啶将被哌啶取代。17、18，皮佩里丁，19，5 GATCACTACTG 3，标签，5 * gatcactactg3，g: DMS，C:肼(盐)，G A:甲酸，20，在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间，只对一些碱进行修饰(不是全部)，其后的破坏反应也是定量反应。因此，DNA链不是在所有可修改的碱基部位断裂，而是随机断裂。在4个反应中，将制作出与同一标记的末端长度不同的4组寡核苷酸片段。只能识别具有标记末端的分段，可以忽略没有标记末端的分段。21，在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间，只修改了碱基的一小部分(不是全部)，然后进行的破坏反应也是定量反应。因

8、此，DNA链不是在所有可修改的碱基部位断裂，而是随机断裂。在4个反应中，将制作出与同一标记的末端长度不同的4组寡核苷酸片段。只能识别具有标记末端的分段，可以忽略没有标记末端的分段。22，23，电泳和读出光谱，在特定测定过程中，先溶解总体积为50L的3段或5段双链DNA，分别为0.03mol/LNaOH，10%甘油，1mmol/L EDTA，0.05%二甲苯蓝和0.05%溴并且，在由5%丙烯酰胺、0.16%0.33%双丙烯酰胺、50mmol/LTris-硼酸、pH8.3的1mmol/L EDTA组成的凝胶板上进行了电泳和放射性自显影等处理，制造了一端带有标记的单链DNA。，24，电泳检测-310

9、，25，阶段：毛细管注浆，步骤26，步骤：移动示例磁盘，27，阶段：电注入和电泳，第28步：荧光激发和检测，29、化学排序方法，化学排序自身现象模式识别读取，化学分解反应完全不是基本特异性的，如果每个排序地图是4个或5个垂直阶梯带，交流反应就更复杂了，因为不能。这块是从橡胶底部的一侧向上读的，G A和C T列包含了一个碱基对另一个碱基对的所有DNA片段。如果G A出现一个条带，则检查g列中是否存在大小相同的条带，如果g碱存在，则检查是否存在无-a碱，同样，C T检查C列中是否存在大小相同的条带，如果C不存在，则检查T是否存在。如果在做AC反应时出现更深的波段，可能有助于用a碱确定。化学法要求4

10、个或5个反应管均匀阅读，DNA的4个碱基分别有一个对应的片段，正在测试的DNA的整个序列可以直接读取。使用32P标记DNA进行化学排序，条带比末端更模糊、更宽，由于分辨率不足，从单个凝胶中获得了大约200-300bp的可靠序列。30，聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链沿长端分离，根据放射自显影标记带直接读取DNA的核苷酸序列。如果G A有一个条带，则检查g列中是否存在大小相同的条带，如果g碱存在，则检查A碱不存在，同样，C T检查C列中是否存在大小相同的条带，如果C不存在，则检查T是否存在。31，AC反应时，有更深的波段时，帮助确定a碱基。32，DNA序列分析的应用，1)测序PCR克隆测序验证突变体检测新的基因测序全基因组测序系统开发和物种鉴定2)片段分离个人鉴定：遗传鉴定SNP相关分析疾病诊断等。33，Maxam-Gilbert化学分解法的测序长度约为250bp，优点：没有酶催化反应，不会发生错误；可以直接对未复制的DNA片段进行测序。化学分解测序尤其适用于测定包含5-甲基腺嘌呤a或g，c含量高的DNA片段和短链的寡核苷酸片段的序列。化学分解排序可以