骨髓检查及细胞化学染色检验

1、骨髓检查及细胞化学染色检验,湖南省第二人民医院 邹国英 85232281骨髓检查及细胞化学染色检验,掌握： 常用细胞化学染色（过氧化物酶染色、过碘酸-雪夫染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色、中性非特异性酯酶染色、碱性-丁酸萘酚酯酶染色、酸性磷酸酶染色、酯酶双染色、骨髓铁染色）的原理、方法、结果分析和临床意义。,骨髓检查及细胞化学染色检验,熟悉： 正常血细胞对化学染色的反应。,骨髓检查及细胞化学染色检验,了解： 流式细胞仪的构造、原理、主要技术指标和临床应用。 染色体分析在临床血液学中的应用。 分子生物学检查在血液学中的应用。 常用FISH技术的

2、种类、原理、方法和临床应用。 常用造血干/祖细胞培养的种类、原理和临床应用。 非显带染色体和显带染色体相关概念和技术。常见染色体数目和结构异常的有关概念和表示方法。核酸分子杂交技术原理和方法。聚合酶链反应原理和常用PCR产物检查方法。以PCR为基础的相关技术。基因芯片技术。 细胞凋亡概念，细胞凋亡形态学的基本变化及主要生物化学特征。细胞凋亡的机制。,细胞化学染色检验,细胞化学染色，是一种以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学物质作定位、定性及半定量分析的方法。,细胞化学染色检验,血细胞化学染色的基本要求是在原位显示细胞成分和结构，反应产物应是有色沉淀物，具有一定的稳定性

3、。 血细胞化学染色可显示糖原、脂类、酶、蛋白质等。,细胞化学染色检验,基本步骤 固定：蒸汽、液体固定 有色沉淀反应：偶氮偶联法、普鲁士蓝反应、雪夫反应、联苯胺法 复染,细胞化学染色检验,临床意义 辅助判断急性白血病的细胞类型 辅助血液系统疾病的诊断和鉴别诊断 观察疾病疗效和判断预后 探讨某些疾病的发病机制,一、过氧化物酶染色（POX）,原理： 粒细胞和单核细胞胞浆中含有的髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）能将底物过氧化氢分解，产生新生态氧，它将四甲基联苯胺氧化为联苯胺蓝。联苯胺蓝自我脱氢氧化，显棕色四甲基苯醌二胺，再加入亚硝基铁氰化钠与联苯胺蓝结合，可形成稳定的蓝色颗粒，定

4、位于细胞浆内酶所在的部位。,POX结果判断,细胞质内有蓝黑色颗粒者为阳性。 （） 无颗粒沉着；（a） （） 颗粒细小 ，分布稀疏；（b） （+） 颗粒较粗，局灶分布；（c） （+） 颗粒粗大，分布较密，占胞质 1/22/3 ；（d） （+） 颗粒粗大，呈团块分布；（e） （+） 全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核（f） 。,各种细胞过氧化物酶染色,嗜碱粒细胞,嗜酸性粒细胞,原幼粒细胞,骨髓片POX染色,临床意义,POX染色是辅助诊断急性白血病细胞类型的首选、最重要的细胞化学染色。 （1）粒系：POX主要分布在粒细胞和单核细胞内，随着粒细胞成熟的程度而逐渐增强，中性分叶核粒细胞为强阳性。 嗜酸性粒细

5、胞阳性程度最强，其阳性颗粒比中性粒细胞粗大，有折光。 嗜碱性粒细胞为阴性。,（2）单核细胞： 原始单核细胞为阴性反应， 幼稚单核细胞和成熟单核细胞呈弱阳性反应，颗粒细小，弥散分布。,临床意义,（3）其他细胞淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、组织细 胞、巨核细胞均呈阴性反应。 （4）血小板过氧化物酶主要定位于幼稚型巨核细胞的核膜上，可作为原巨核细胞的一种标志物，有助于FAB M7的识别。,临床意义,骨髓片POX染色,APL：呈强阳性反应,AML-M4：部分呈阳性反应， 部分成弱阳性反应,AML-M5：呈弱阳性,ALL：呈阴性，3%,临床意义,（5）过氧化物酶染色 主要用于鉴别急性白血病类型， 急性髓细

6、胞白血病多呈阳性反应，以M3和M2型反应最强，M1和M5型反应较弱， 故有助于区别M3和M5型。 急性淋巴细胞白血病呈POX阴性反应，故为急性髓细胞和淋巴细胞白血病鉴别的重要指标。,二、中性粒细胞碱性磷酸酶染色 （NAP）,原理：（偶氮藕联法，Kaplow） 中性粒细胞内碱性磷酸酶（neutrophilic alkaline phosphatase, NAP）在pH9.29.8时，能水解磷酸萘酚钠，释放出磷酸与萘酚，再以重氮盐与萘酚偶联成不溶性有色沉淀于胞质内酶所存在的部位。,NAP结果判断,阳性结果为胞质内出现灰褐 色至深黑色颗粒状或片状沉 淀 （）胞浆呈淡红色，为0分。 （）胞质出现灰褐色

7、沉淀， 为1分。 （）胞质深褐色沉淀，为 2分。 （）胞质中已基本充满 棕黑色颗粒状沉淀，但密度较 低，为3分。 （）胞质全被深黑色 团块沉淀所充满，密度高，甚至 遮盖胞核，为4分。,NAP积分法 计数100个成熟中性粒细胞，按其反应强度分级，各级百分率与其级数乘积的总和，即为积分。 例如： NAP反应结果（%） （-） （+） （+） （+） （+） 20 40 20 15 5 积分=（020）+ （140）+（220）+（315）+（45）=145 参考值：正常人血细胞碱性磷酸酶除成熟中性粒细胞（杆状核及分叶核）可见阳性外，其他血细胞均为阴性。 中性粒细胞NAP活性积分值一般为1050分，

8、但有时可高达162分。,临床意义 （1）生理变化： 新生儿NAP增高，成人较儿童减低，老人更低；激烈运动增高； 月经期经前增高，行经后降低，经后期恢复正常； 妊娠期2-3月轻度增高，以后逐渐增高，分娩时达到高峰，产后恢复正常。,（2）、病理变化 增高：严重化脓性感染、类白血病反应、AA、CML加速期、ALL、CLL、恶性淋巴瘤、癌转移、MM、真红、骨髓纤维化等。 减低：PNH、CML、恶性组织细胞病、MDS。,三、苏丹黑染色 （SBB）,原理： 苏丹黑B（sudan black B,SB）是一种能溶解于脂肪中的色素染料，可 使细胞内的中性脂肪、磷脂和类固醇着色，即使胞内微细结构的脂类物质也 能

9、显示出来。 结果 ：脂类呈黑色或棕黑色颗粒，定位于细胞浆中 （+） 颗粒很小，细小、稀疏，或胞质局部面积的1/4有致密的颗粒。 （+）颗粒较少，或胞质面积的1/2出现黑色颗粒。 （+）颗粒较密，或胞质面积的3/4出现黑色颗粒。 （+） 颗粒极密，颗粒间无间隙。,各种细胞苏丹黑B染色,临床意义 苏丹黑B和过氧化物酶染色临床意义相似主 要用于急性白血病类型的鉴别。 苏丹黑B染色较过氧化物酶染色更敏感，但 特异性不如过氧化物酶染色（极少数急性淋巴细胞白血病可为阳性）。,M1-SBB(+),M2-SBB(+),四、铁染色,原理： 骨髓中的含铁血黄素（细胞 外铁）和中、晚幼红细胞胞 浆中的铁蛋白聚合物（

10、细胞 内铁）经普鲁士蓝反应形成 蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定 位于细胞内外铁存在的部 位。正常人骨髓细胞 外铁为+。铁粒幼细胞阳 性率为12%44%。铁染色 （iron stain；IS）中的细胞 外铁反映骨髓中铁的储存 量，细胞内铁反映骨髓中可 利用铁的量。,结果判断,（1）细胞外铁的观察 ： 细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小株状或团块状。 以油镜观察定级标准 （-） 无铁粒可见。 （+） 少数铁粒或铁小珠。 （+） 较多铁粒和铁小珠。 （+） 很多铁粒、铁小珠和少数小块。 （+）极多铁粒、铁小珠并有很多小块，密集成堆。 正常范围：+，“+”占2/3，“+”占1/3,细胞外铁观察,阳性为蓝绿色沉淀,+

11、 血色病,+ AA、铁粒幼贫血,+ 感染,+ AA、铁粒幼贫血,+ NBM, IDA,结果判断,（2）细胞内铁观察： 细胞内铁指有核红细胞胞质内出现蓝色颗粒，以油镜计100个中、晚幼红细胞，记录胞质中含有蓝色小颗粒（即铁粒红细胞）的比值。并根据细胞铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布情况，将铁粒幼红细胞分为如下四型： 型：仅含1-2个铁颗粒。 型：含3-5个铁颗粒。 型：含6-10个以上铁颗粒。 型：10个铁颗粒。 正常范围：12% 44% ，平均21.4%， 多见型，少见型，无、型。,细胞内铁,结果判断,（3）环形铁粒幼红细胞： 指含铁颗粒6个，其中1/2以上铁颗粒围绕核周排列成完整环形或

12、不完整环形。 正常或非铁粒幼细贫血无环形铁粒幼细胞，铁粒幼细贫血中环形铁粒幼细胞6%,环形铁粒幼细胞,临床意义 1缺铁性贫血时， 骨髓细胞外铁明显减少，为“一”“士”，细胞内铁平均5.9%，仅为I 型。经有效铁剂治疗后，外铁增多。因此骨髓铁染色是诊断缺铁性 贫血及指导铁剂治疗的重要方法。 2铁粒幼细胞性贫血时， 外铁“2”一“3”，内铁平均70%，其铁粒粗大，以 型为 主，出现较多环形铁粒幼细胞。因此，本实验是诊断铁粒幼细胞贫 血的有效方法。MDS也可出现环形铁粒幼细胞。 3. 非缺铁性贫血 如巨幼细胞贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等骨髓铁正常或不同程度 的增加。但再生障碍性贫血不会出现环形

13、铁粒幼细胞，可作为与MDS鉴别 的参考。 4. 继发性贫血的部分患者细胞内铁可减少，但细胞外铁不减少。,五、过碘酸-雪夫染色（PAS）,原理： 过碘酸-雪夫（Periodic acid-schiff，PAS）染色又称糖原染色。胞浆内存在的糖原或多糖类物质（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖酯等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）经过碘酸（Periodic acid）氧化，转变为二醛基（CHO-CHO），与雪夫（Schiff）试剂中的无色品红结合，形成紫红色化合物而沉积于胞浆中糖原类物质所存在的部位。该反应称为过碘酸-雪夫（PAS）阳性反应。,PAS结果判断,细胞质内有出现红色颗粒、块状 或呈弥漫状红

14、色者为阳性。 （）胞质无色，无颗粒。 （+）胞质淡红色或有少量红色颗粒，通常10个颗粒。 （+）胞质红色或有10个以上红色颗粒。 （+）胞质呈暗红色或有粗大红色颗粒，可出现红色块状。 （+）胞质呈紫红色或有粗大红色块状。,临床意义 （1）M6与巨幼贫的鉴别 M6的幼红细胞PAS可呈强阳性，积分明显增高，巨贫、再障、溶贫时PAS反应为阴性。 （2）急性白血病的类型鉴别 ALL，PAS呈大块状阳性，也可是阴性，AML为阴性，急性单核细胞白血病时原单核细胞及幼单核细胞PAS阳性，积分增高，阳性颗粒小而多，呈弥散分布。,PAS染色,AML-M6 幼红细胞呈阳性反应,MA 幼红细胞呈阴性反应,ALL-L

15、1,L1 PAS(+),AML-M5,M5 PAS(+),AML-M6,AML-M6 PAS(+),AML-M7,M7 PAS(+),（3）巨核细胞和Sternberg细胞鉴别 巨核细胞PAS强阳性，Sternberg细胞为阴性或弱阳性。 （4）戈谢氏细胞强阳性，尼曼-皮克细胞阴性或弱阳性。 （5）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴细胞的糖原积分增高；一般的病毒感染，糖原积分在正常范围内。,六、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS-DCE）,原理： 细胞内的氯乙酸ASD萘酚酯酶（naphythol AS-D chloroacetate esterase,NAS-DCE）水解基质液中的氯乙酸ASD萘酚，产

16、生ASD萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所存在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的有色沉淀为红色。NASDCE几乎仅出现在粒细胞，其特异性高，因此又称为“粒细胞酯酶”、“特异性酯酶”。,结果判断,阳性结果为胞质内出 现红色沉淀 （）胞质无色。 （）胞质呈淡红色。 （）鲜红色沉淀布满胞质。 （）深红色沉淀充满胞质。,临床意义 1急性粒细胞白血病和急性早幼粒细胞白血病原粒细胞NASDCE染色多呈（）（）。白血病性早幼粒细胞呈（）（）。 2急性单核细胞白血病原、幼单核细胞多呈阴性反应。 3急性淋巴细胞白血病 原、幼淋巴细胞呈阴性反应。,七、中性非特

17、异性酯酶染色,原理： 中性非特异性酯酶包括醋酸AS-D萘酚酯酶(naphytholAS-D acetate esterase,NAS-DAE)染色和-醋酸萘酚酯酶（naphythyol acetate esterase , -NAE）染色。细胞内的-醋酸萘酚酯酶（naphythyol acetate esterase , -NAE）在pH中性的条件下水解基质液中的-醋酸萘酚，释放出-萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢蓝B，形成的有色沉淀为棕黑色或灰黑色，-NAE存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，故它是一种中性非特异性酯酶

18、。,结果判断,阳性结果为胞质内出现 蓝色或棕黑色颗粒沉淀 （）无颗粒沉淀，为0分。 （）颗粒少量、稀疏，为0.5分。 （）胞质内1/2区域出现颗粒沉淀，为1分。 （）胞质内3/4区域出现颗粒沉淀，为2分。 （）胞质内布满颗粒沉淀，为3分。 （）胞质内充满浓密的颗粒沉淀，为4分。,临床意义 NASDAE染色属于中性非特异性酯酶染色， 在鉴别白血病类型时需同时做NaF抑制试验。 1急性粒细胞白血病原粒细胞NASDAE染色可呈阳性反应，且不被氟化钠抑制。 2急性早幼粒细胞白血病白血病性早幼粒细胞NASDAE染色为阳性或强阳性反应，亦不被氟化钠所抑制。 3急性单核细胞白血病原、幼单核细胞NASDAE染色多呈阳性或强阳性反应，但能被氟化钠抑制,骨髓NAS-DAE染色及氟化钠抑制反应,细胞化学染色检验小结,几种常见急性白血病的细胞化学染色结果,各型急性白血病细胞的化学染色特征 POX PAS NASDCE NASDAE （NaF）NAP急淋（L1-L3 ） (-) (+)(+) (-) (-)(+) 不抑制 急粒（M1 M2） (-)(+) (-)(+) (+)(+) (-)(+) 不抑制急早幼粒（M3）(+)(+)(+)(+) (+)(+)