生化与分子生物学研究思路与技术2hr.ppt

1、1,生化与分子生物学研究思路与技术,中南大学 生物科学与技术学院 生物化学系,生物化学研究所 陈汉春E-mail: ,2,生物化学 :,研究活细胞及有机体内各种分子及其相互间化学反应的科学。 研究活细胞的化学组成及相互反应和进程的科学，即“生命的化学” 。 生命科学的基础语言，即研究生命的分子基础(molecular basis of life)。,3,一.生物化学研究的目的：,从分子水平了解活细胞相关的所有化学进程。 对健康、营养的理解和维持以及对疾病的发生机理的阐明和有效治疗。,4,二.生物化学的研究对象：,研究生物分子的组成成分如碳、氢、氧、氮、磷等化学元素

2、以及水和无机盐代谢。 研究生物大分子如DNA、RNA、蛋白质、多糖及脂类的结构、功能、结构与功能的关系以及这些生物大分子的代谢和相互作用。,5,三.生物化学研究的发展：,生物化学研究历经两百多年进入分子生物学年代，走过了三个发展阶段： 叙述生物化学阶段 动态生物化学阶段 功能或分子生物化学阶段,6,叙述生物化学(descriptive biochemistry)阶段(17701903),又称为静态或形态生物化学(static or morphological biochemistry)。该时期多依附于有机化学，开始详尽研究生物体内主要化学物质的组成，分离出各种氨基酸、脂酸、甘油、糖类、柠檬酸、

3、乳酸和苹果酸。从肝中分离糖元，发现了核质（nuclein）及核酸。奠定了酶学基础理论。基本上解决了酶的催化特性、作用机理和影响因素等问题。,7,我国人民在公元前二十一世纪，已用曲酿酒，称曲为酒母，又叫做酶；公元前十二世纪，已将豆、谷发酵，捣烂、加盐以造酱，并制出麦芽糖，当时称为 “饴”。公元九世纪或十世纪已制成豆浆和豆腐。,此阶段中国人民的贡献：,8,2. 动态生物化学(dynamic biochemistry)阶段（19031950）,又称为生理化学（physiological chemistry）。该时期主要研究生物体内组成物质的化学变化及相互转变。分离制备结晶酶，阐明细胞氧化和呼吸链及维

4、生素和激素化学性质与生理作用。建立了有关发酵和三羧酸循环、脂酸的氧化作用以及肝中尿素合成的完整生化途径，能初步动态地解释许多生命现象的本质，如生长、发育、生殖、呼吸、造血和消化等，使生物化学进入了一个兴旺的发展时期。,9,此阶段中国人民的贡献：,该时期，我国生物化学家建立了血滤液制备与血糖测定的生化方法，迄今还为实验室采用。在蛋白质研究中，提出了蛋白质变性学说，并一直获得世界同行公认。在免疫学方面，首先使用定量分析技术研究抗原抗体反应的机理。,10,3. 功能或分子生物化学（functional or molecular biochemistry）阶段 （1950年至今）,该时期主要从分子水平

5、探索蛋白质、酶和核酸等生物大分子结构与功能的相关和它们的相互作用，包括蛋白质和核酸的提纯，其化学组成、氨基酸或核苷酸的一级结构序列以及空间构型、构象的确定，DNA双螺旋结构模型的建立，生命物质如肽激素、tRNA和核酶的人工合成，分子克隆技术的建立，代谢调控和生物膜研究的开展，均有助于揭开生命起源和实现对疾病的基因治疗。分子遗传学和遗传工程技术的建立，为培养动植物的新品种，促进工农业的变革，提供了新思路。,11,此阶段中国人民的贡献：,该时期，我国生化工作者于1965年首先成功合成了有生物活性的牛胰岛素，1972年借助X-射线衍射技术研究了猪胰岛素分子的晶体结构，1981年首次合成具生物活性的酵

6、母丙氨酸tRNA。九十年代，成功制备重组因子和促红细胞生成素（erythropoietin），参与完成人类基因组计划。,12,四.生化研究的基本思路 和技术路线：,经典的生物化学研究包括三个主要步骤： 分离细胞器和生物分子。 判断生物分子的结构。 分析生物分子的功能和代谢（合成与 分解）及其相互作用。,13,1 .细胞器和生物分子的分离：,细胞器是一种独立亚细胞单位，具有膜结构。按照这个定义，核糖体、细胞骨架还有细胞质都不属于细胞器。然而，我们可以把它们看作一种亚细胞功能实体。一般采用匀浆及离心等操作过程进行亚细胞分离。分离后还必须采用测量“标志”酶及特殊化学成分或电子显微镜观察的方法来评估各

7、亚细胞组分。,14,像分析细胞器一样，如果要了解生物分子的结构，首先必须得到纯化的生物分子。用于分离和纯化生物分子的方法层出不穷，例如盐析法、层析法(纸、离子交换、薄层、气液相、高压液相层析)、凝胶过滤、电泳(纸、高压、琼脂糖凝胶、醋酸纤维素簿膜、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶、SDS-PAGE)、超速离心等。要得到均一性的生物分子往往需要综合性采用多种方法。,15,细胞器的标志性成分和主要功能,16,2 .生物分子的结构确定 ：,质谱和核磁共振已成为结构分析的常规方法。某些已知特性的酶已成为分析某些生物分子结构的有用工具。利用高清晰度的核磁共振质谱仪可以分析许多蛋白质和某些生物分子上复杂的糖链结构，

8、使用X-射线衍射和晶体学方法可以得出生物分子的精细结构(fine structure)。目前用于确定生物分子结构的经典方法包括元素分析、紫外光谱、可见光谱、红外光谱和核磁共振光谱、用酸或碱将待研究的生物分子水解成为其基本成分、利用多种已知特性的酶(如蛋白酶、核酸酶、糖苷酶)降解待研究的生物分子等。,17,3 .生物分子的功能和代谢分析：,1）生物分子的功能分析 人类和动物的研究最初是从动物整体水平开始的，例如对呼吸和消化的研究。很明显要在动物整体水平研究中找到问题的确切答案是复杂和困难的。因此将许多整体动物水平的复杂现象转移到体外研究则简单得多。,18,不同层次研究生物分子功能的方法,19,2

9、）生物分子的代谢分析：,生化代谢途径是指一系列由酶催化的生物化学反应，这些反应包括由一个或多个简单的分子合成复杂的复合物以及一个复合物降解为其终产物的过程，复杂的生化反应和特定的代谢途径的存在是从整体动物水平观察到的。,20,某些氨基酸、糖和脂肪酸可以与一个合适的稳定同位素结合，然后注入动物体内或用于体外实验来观测它们的代谢过程（例如半衰期及与其它生物分子的转化）。标记有合适的稳定同位素的复合物可以用来观察蛋白质、糖类和脂类的代谢过程。这些研究证实代谢是一个很活跃的过程，细胞内大部分复合物都在不停地合成和降解。,21,五.分析生化反应的总体策略 ：,整体动物水平观察和推论某种生化反应或代谢途径

10、的存在 体外研究它的调控机制 分析它在特定疾病中的作用 将它定位于一个或多个器官 定位于一个或多个细胞器或亚细胞组分 确定与之相关的其它生化反应 纯化该反应的底物、产物、酶和辅因子及其它成分 确定该反应的体外控制机制 分析该反应的体内调控机制 体内外重建该反应 用重组DNA技术在基因水平研究该反应。,22,六.生化研究技术的进步：,生命科学研究的主要目的在于获得最新的基础信息，例如纯化和鉴定新发现的酶及其功能，生物化学是生命科学领域的一个重要分支，生化研究实验技术飞速发展，分子生物学新技术、新方法不断涌现，为生命科学研究工作者提供了有用的工具。,23,1.细胞器及生物分子的分离与纯化：,活细胞

11、中简单的生物分子是大分子的结构单位，大分子是超分子复合物的成分，超分子复合物装配成细胞器，细胞器则和其它结构一起组成细胞。因此，细胞的功能实际上是细胞内亚细胞结构及其生物分子功能的综合体现。为了研究细胞器及生物分子的结构与功能以及其代谢和作用机制，必须从组织或细胞中分离出来这些生物分子或亚细胞复合物。,24,基本技术：,匀浆 离心 层析 电泳,25,1）匀浆:,破坏细胞或组织的固有结构，使 细胞破裂而释放胞内容物 。 方法: 化学(酶消化)、物理(超声)或机械(碾磨)。 要求: 保持生物分子或亚细胞结构的完整性。 措施: 合适pH值、合适离子强度、缓冲液、 低温(0 4 ) 、短时间、蛋白酶抑

12、 制剂、核酸酶抑制剂。,26,使样品绕离心机转轴的中心旋转而获得一个 远大于地球重力的沉降应用力，样品介质中 不同大小、形状和密度的颗粒将以不同的速 度沉降。 影响因素: 离心力(转速及颗粒与中心轴的 距离)，颗粒的大小、形状、密 度，介质的粘度。,2）离心：,27,低速离心: 6 000 r/min 、室温， RCF (相对离心力)6 000 g ； 高速离心: 6 000 25 000 r/min 、低温， RCF = 6 000 60 000 g ； 超速离心: 25 000 r/min 、低温 + 真空， RCF = 60 000 600 000 g ； 差速离心: 连续用几种递增的离

13、心速率离心。 密度梯度离心: 样品中不同组份在离心力场的 作用下停留于相应密度的支持物 层面(如Percoll分离血细胞)。,类型:,28,根据样品中各组分物理生化特性、分子大小形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性或亲和性等的不同而将它们分离。 类型: 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤、疏水相互作用层析、亲和层析、共价层析和金属螯合层析。,3）层析（色谱分析）：,29,常用层析法:,薄层层析和纸层析； 柱层析； 高效液相层析 ； 气相色谱。,30,薄层层析和纸层析:,将样品点在薄层或纸(支持基质又称层析床或固定相 )的一端，展层剂(流动相)沿着薄层或纸向上展开并带动样品中的物质迁移

14、。 相对迁移率: Rf = 组分移动距离/溶剂移动距离； Rx = 待测物移动距离/标准物移动距离。,31,柱层析:,将样品从装有固定相的柱顶部加入，然后在重力或蠕动泵的作用下使流动相过柱并带动样品中的不同组分进入固定相，样品中各组分在固定相中会形成不连续带型，继而用流动相洗脱，用一系列试管分别收集各时间段流出的洗脱液进行定量或定性分析。,32,33,4）电泳：,根据带电荷的物质在电场中移动的原理而分离、分析复杂混合物及纯化、鉴定离体生物分子。 影响因素: 荷电分子在电泳过程中的迁移率取决于分子所带的净电荷量、分子的形状与大小及电场强度。,34,电泳支持物:,惰性支持物(如醋酸纤维素) : 仅

15、提供物理支持，分离的效果只取决于分子的电荷 密度 。 多孔支持物(如Agarose、PAG) : 同时利用了分子筛效应，分离效果取决于电荷密度 和分子大小及形状。,35,电泳缓冲系统:,连续缓冲系统: 指样品、凝胶和缓冲液含有相同的缓冲离子， 具有相同的pH值。 非连续缓冲系统: 指凝胶及缓冲液中的缓冲离子和pH值均不同。,36,常用电泳技术:,基本电泳 等电聚焦 毛细管电泳 双向电泳,37,基本电泳: 纸电泳、醋纤膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、 聚丙烯酰胺凝胶电泳。,38,39,等电聚焦: 等电聚焦在pH梯度下进行。pH梯度由结构类似的小 分子量两性电解质形成，这些两性电解质的等电点 (pI)在p

16、H 310之间。当存在外加电场时，每一种 两性电解质向其pI值处移动而形成稳定的pH梯度。 电泳过程中每一种带电分子如蛋白质都朝自己的pI 位置移动而被分离。,40,毛细管电泳:,毛细管电泳的特点在于分辨力高和应用范围广，可以分析极少量的样品(5 nl10 nl)和各种生物分子如氨基酸、蛋白质、核酸、药物、维生素、有机及无机离子等。较常应用的有毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦。,41,双向电泳,双向电泳是一种分辨力极高的电泳技术，目前广泛用于基因 表达谱及蛋白质组学分析。 第一向: 根据蛋白质所带的电荷而进行等电聚焦。 第二向: 利用样品分子的相对分子质量不同，在另一方向上进行S

17、DS- PAGE。 双向电泳可一次性分离1000种蛋白质。双向电泳图谱的分析 需要由计算机辅助的凝胶扫描仪来获取、储存和处理从图谱 中得到的数据，既可准确分析斑点又可进行单一蛋白质的定 量分析。,42,43,2D gel in proteomics,44,点匹配结果:,实验组和对照组蛋白点匹配图,45,2.生物分子的分离与纯化：,1）蛋白质纯化； 2）DNA提取； 3）RNA提取； 4）糖类提取； 5）脂类提取。,46,1）蛋白质纯化:,目的: 确定蛋白质的结构、功能及结构与功能的关 系；研究酶的动力学及其调节；药用成份的 分离与鉴定。 方法: 匀浆、离心、电泳、过滤、层析、抽提、透 析等。

18、要求: 合适的缓冲体系、低温、蛋白酶抑制剂。 浓度和质量检测: 分光光度法、PAGE 。,47,2）DNA提取:,原则 : 保持核酸一级结构的完整性。 去除杂质，保证核酸足够纯。 步骤： 破膜 释放出目的核酸分子。 分离 通过酶、有机溶剂、调节pH 值、离心等手段得到粗制品。 纯化 进一步去除杂质。 浓度和质量检测: 分光光度法、 Agarose凝胶电泳。,48,基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱 M: DNA/HindIII 分子量标准， 泳道14分别代表4个不同样品的基因组DNA,49,3） RNA提取:,哺乳动物细胞总RNA主要由rRNA(80%-85%)、tRNA和核内小分子RNA (1

19、0%-15%)、mRNA(1%-5%)组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。 注意事项: 使用RNA酶抑制剂； 防止污染。,50,总RNA和mRNA的琼脂糖凝胶（1）电泳图谱,51,七. 生物分子的结构与功能分析：,1. 蛋白质结构分析 2. 酶活力检测 3. 蛋白质组学分析 4. DNA序列分析 5. 聚合酶链反应（PCR）6. 分子杂交 7. 基因克隆 8. 基因组文库构建 9. cDNA文库构建 10. 文库筛选 11. 报告基因检测 12. 基因芯片 13. 基因敲除 14. RNAi 15. 转基因动物,52,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,测定多肽链的氨基末端与羧基

20、末端的氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,1. 蛋白质结构分析:,53,通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,54,2. 酶活力检测:,酶是一类加快特定生化反应速度的球蛋白。在底物浓度、pH值及温度等适宜的条件下，每种酶控制着一些结构相似的底物生成产物。 通过酶反应速度来测定酶活性，推荐使用的酶活性单位(SI单位)指在最适条件下，一

21、秒内将1 mol底物全部转化为产物所需的酶量。,55,3. 蛋白质组学分析:,一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome)。蛋白质是基因功能的实施者，因此对蛋白质结构、定位和蛋白质-蛋白质相互作用的研究将为阐明生命现象的本质提供直接的基础。 方法: 二维电泳、质谱技术、蛋白质芯片等。,56,4. DNA序列分析:,DNA序列分析(DNA sequencing)即测定DNA链中四种核苷酸(碱基)的排列顺序。 测序反应使用特异引物与单链DNA模板结合，由DNA聚合酶催化引物延伸，当遇到双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)时即发生碱基特异性链终止，而引物延伸合成的新

22、链DNA即是待测DNA模板的互补链。 反应中加入一种带有放射性同位素(如32P或35S)的底物dNTP，这类具有放射活性的dNTP同样遵循碱基互补配对原则而掺入新合成的模板互补链中。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后对X-光片曝光即可获得长度相差一个核苷酸的DNA链分离图谱。,57,5. 聚合酶链反应（PCR）:,Polymerase chain reaction（ PCR）技术是利用DNA 聚合酶在体外条件下，催化一对引物之间特异DNA片段合成的基因扩增技术。 PCR包括三个基本过程： 变性。在高温条件下使双链模板DNA解链成为单链DNA； 退火。在较低温度时使加入的引物与单链DNA模板特异性结

23、合； 延伸。在适当的温度下，Taq DNA聚合酶从结合到DNA模板上的引物3-OH端开始，根据碱基互补配对原则，按照DNA模板核苷酸序列，进行DNA链的延伸，合成与模板互补的新的DNA分子。 这三个过程组成一个循环周期,每个周期合成的产物又可作为下一个周期的模板，如此循环往复，目的DNA片段的拷贝数呈指数形式扩增，从而获得大量的目的DNA片段用于进一步分析。,58,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。

24、 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,6. 分子杂交(hybridization),59,DNA-DNA 杂交双链分子,不同来源的DNA分子,60,Southern印迹杂交 :,利用琼脂糖凝胶电泳将经限制性核酸内切酶消化的DNA片段分离，并使这些DNA片段在凝胶原位经碱变性处理(解链成单链)后, 从凝胶转移至一固相支持物(通常是硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上，再与放射性标记或非放射性标记的核酸探针杂交，经放射自显影、酶底物显色或化学发光等方法确定膜上与探针互补的电泳区带位置。,61,Northern印

25、迹杂交 :,用于检测组织、细胞中某基因的表达状态和表达水平。 基本原理和方法与Southern印迹杂交相似: RNA在琼脂糖凝胶中电泳分离后，被转移至尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，然后与标记的DNA或RNA探针杂交。 为了筛选差异表达基因, Diatchen等建立了抑制性消减杂交技术。,62,Western免疫印迹:,基本原理与Southern 印迹杂交和Northern印迹杂交十分相似，都是由凝胶电泳、转膜、杂交和信号显示等步骤组成。不同之处是Western免疫印迹检测的是蛋白质，使用的凝胶是SDS聚丙烯酰胺凝胶, 所用的探针是蛋白质抗体，而不是核酸。,63,7. 基因克隆:,重组DNA技术是用

26、酶学方法将不同来源的DNA分子在体外进行剪切和重新连接, 组装成一个新的DNA分子。在此基础上，将这个DNA分子导入到一定的宿主细胞，使它能够在宿主细胞中扩增，形成大量的子代分子，此过程即称为基因克隆(gene cloning)。,64,基因克隆包括四个基本技术环节：, 目的基因和载体的获得； 目的基因与载体连接，形成重组分子； 重组DNA分子导入宿主细胞； 含有重组DNA分子的细胞的筛选和扩增。,65,8. 基因组文库构建:,基因组文库(genomic DNA library)是含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群体。 构建文库时，先提纯染色体DNA，通过机械剪切或酶切使之成为一定

27、大小的片段，然后与适当的载体（如噬菌体）DNA连接，经体外包装后转染宿主菌，得到一组含有不同DNA片段的重组噬菌体颗粒，含有目的基因片段的重组子可通过标记探针与基因组文库杂交而筛选出来，用于进一步的研究。,66,9. cDNA文库构建:,cDNA是指以mRNA为模板，由逆转录酶催化形成的互补DNA（cDNA），其核苷酸序列完全互补于模板mRNA链；再以cDNA为模板，由DNA聚合酶合成第二链，得到互补双链DNA。,67,由于模板mRNA含有该种细胞的各种mRNA分子，因而合成的cDNA产物是各种mRNA拷贝的混合物；然后将双链产物与载体（质粒或噬菌体）DNA重组，并转化到宿主细菌或包装成噬菌体

28、颗粒，得到一系列重组的克隆混合体。每个克隆含单独一种mRNA分子，克隆总和则包含细胞的全部mRNA信息，此即为cDNA文库(cDNA library)。,cDNA文库(cDNA library):,68,10. 文库筛选:,文库筛选方法有多种,如核酸分子杂交、利用抗原抗体结合的免疫学方法等。 通过文库筛选，可以获得基因全长、分离出对应稀有mRNA的cDNA片段及鉴定目的重组子等。,69,11. 报告基因检测:,报告基因(reporter gene)是指那些表达产物容易被检测的基因。含报告基因的载体是研究顺式作用元件的重要工具。为了检测顺式作用元件的部位及功能，利用基因重组技术，将待检测的DNA

29、片段插入报告基因表达载体中报告基因的上游，然后转染合适的细胞并表达，通过测定报告基因的表达产物，即可推测出该DNA片段在基因表达调控中的作用。,70,12. 基因芯片:,基因芯片(gene chip)是九十年代中期发展起来的一项前沿生物技术，它融合了生命科学、化学、微电子技术、计算机科学、统计学和生物信息学等多学科的最新技术。,71,DNA芯片（基因芯片）,将大量的已知的DNA片段为探针，有序地、高密度地排列在玻离、硅等载体上。 将待测样品用荧光标记物标记，并与DNA芯片进行分子杂交后进行信号检测。通过对芯片扫描获得荧光标记杂交信号图谱。,72,芯片设计,73,目 录,74,13. 基因敲除:

30、,基因敲除（gene knock out），类似早期生理学研究的三部曲: 切除部分观察整体推测功能。 gene knock out是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它序列相近基因取代，然后从整体及分子水平观察实验动物，推测相应基因的功能。,75,基因敲除的技术路线：,（1）构建重组基因载体。（2）用电穿孔、显微注射等方法将重组DNA转入受体细胞核内。（3）用选择培养基筛选已击中的细胞。（4）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。基因敲除的靶细胞目前最常用的是小鼠ES细胞。,76,siRNA (small

31、interfering RNAs： 2123核苷酸长的 dsRNA小片段 ),14. RNA interference 双链RNA对基因表达的阻抑作用被称为RNA干预（RNA interference, RNAi），是发生在转录后水平的基因沉默。,77,安德鲁法尔(Andrew Fire， 1959年)， 美国斯坦福医学院病理学和遗传学教授,克雷格梅洛(Craig C. Mello, 1960年)，美国马萨诸塞州大学医学院分子医学教授。,78,RNA干扰过程图,79,RNAi研究被Science杂志评为2001年的十大科学成就之一； RNAi研究被列为2002年Science杂志评的十大科学成

32、就之首； RNAi研究被授予2006年诺贝尔生理学或医学奖； Dr. Fire and Mello分享了1000万瑞典克朗（约合140万美元）的奖金。 “沉默” 是金。,80,15. 转基因动物:,转基因动物（transgenic animal）技术是通过遗传工程的手段对动物基因组的结构或组成进行人为的修饰或改造，并通过相应的动物育种技术使得这些经修饰改造后的基因组在世代间得以传递和表现。,81,八. 生物大分子相互作用分析:,生化反应过程实际上是生物分子间的相互作用过程。生物大分子间的相互作用是它们的功能基础。随着分子生物学研究的进展，建立了一系列研究核酸及蛋白质相互作用的技术。,82,生物大分子相互作用分析技术:,凝胶阻滞分析法 DNA酶足纹分析法 蛋白质芯片 酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白质,83,1. 凝胶阻滞分析法:,凝胶阻滞分析法(gel retardation assay)又称迁移率改变法(mobility shift assay)或凝胶电泳DNA结合分析法,是一种简单快速而又灵敏可靠的用于检测DNA结合蛋白的实验方法。