DNA重组及重组DNA技术(一)

1、掌握： 基因芯片、蛋白质芯片、基因文库的概念； 酵母双杂交技术、 标签蛋白沉淀原理及应用； 染色质免疫沉淀技术的基本原理及应用。 了解： 基因芯片和蛋白质芯片的基本原理、EMSA基本原理。,标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。,（一）标签蛋白沉淀,标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。,标签融合蛋白沉淀实验流程示意图,GST:谷胱甘肽S-转移酶,酵母转录激活因子GAL4的结构,DNA结合域 (binding domain, BD),转录激活域 (acti

2、vation domain, AD),GAL4,（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途,（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途,猎物,DNA Recombination and Recombinant DNA technology,第二十一章 DNA重组和重组DNA技术,掌握： 同源重组、接合、转化、转导的基本概念； 重组DNA技术（基因工程，DNA克隆） II型限制性核酸内切酶； 载体 基因工程操作过程：分、选、接、转、筛； 真核表达体系常用的受体细胞和转染方法； 原核表达体系的缺点。 了解： 特异位点的重组；转座重组；基因工程技术在医学中的应用。,DNA重组（DNA recombination

3、）是指不同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。,第一节自然界DNA重组和基因转移 DNA Recombination and Gene Transfer in Nature,DNA重组,同源重组 (homologous recombination) 位点特异的重组(site-specific recombination) 转座重组(transposition recombination) 接合作用 (conjugation) 转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction),原核生物,发生在同源序列间的重组称为同源重组(

4、homologous recombination)，又称基本重组（general recombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型,一、同源重组是最基本的DNA重组方式,同源重组在DNA损伤修复中的作用,同源重组产生的染色质片段交换,减数分裂中的同源重组,安吉丽娜朱莉于2013年5月14日公布自己已经接受预防性双乳腺切除手术。朱莉透露做出如此 重大的决定的原因：她的母亲与乳腺癌抗争多年，仍不幸在56岁病逝。而她经检测发现自己与母亲一样都存在基因

5、BRCA1/2突变，患乳腺癌的几率高达 87%，因而选择了预防性切除手术。,1964年提出Holliday模型,分支移动,Holliday连接体,Holliday模型的4个关键步骤：,两个同源染色体DNA排列整齐；,一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；,通过分支移动产生异源双链DNA；,Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：,Holliday中间体,5,拼接重组体,片段重组体,片段重组体 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。,拼接重组体 切开的链并非原来断裂的链，重组体

6、异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。,Holliday模型的4个关键步骤：,两个同源染色体DNA排列整齐；,一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；,通过分支移动产生异源双链DNA；,Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：,参与细菌DNA同源重组的酶有数十种，其中最关键的是RecA蛋白、RecBCD复合物和RuvC蛋白。 RecBCD复合物具有三种酶活性，即依赖于ATP的核酸外切酶活性、可被ATP增强的核酸内切酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。 RecA蛋白可结合单链DNA（ssDNA），形成RecA-ssDNA复合物。

7、 RuvC有内切酶活性，能专一性识别Holliday连接点，并有选择地切开同源重组体的中间体。,应用: 基因敲除,二、原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组,（一）接合作用,当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。,F 因子介导的接合作用,接合作用,（二）转化作用,通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。,例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。,When injected into mice,

8、the encapsulated strain of pneumococcus is lethal.,Griffiths experiment in 1928,whereas the nonencapsulated strain is harmless.,Avery,AveryMacLeodMcCarty experiment in 1944,（二）转化作用,通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。,（三）转导作用,当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的

9、DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。,Lambda-噬菌体 生活周期,普遍性转导： 供体菌DNA被包装入噬菌体 特异性转导： 整合入噬菌体再转移至受体菌,思考题,1.当细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞转移至另一细胞或细菌，这种类型的DNA转移称为： A.接合作用 B.转导作用 C.转化作用 D.转座重组 E.特异位点重组,2. 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，这就是： A.接合作用 B.转导作用 C.转化作用 D.转座重组 E.特异位点重组,第二节 重组DNA技术,Recombinant DNA Tec

10、hnology,重组DNA技术相关概念,克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,DNA克隆,技术水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）,其主要过程包括：在体外将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。,重组DNA技术，又称分子克隆（molecular cloning）或DNA克隆（DNA cloning）或基因工程（genetic engineering）技

11、术,expression,思想基础： 1. DNA重组在自然界中不断发生；DNA可在不同个体及物种中转移(1964Holliday模型) 2. DNA承载遗传信息(1944转化实验；1953双螺旋结构；中心法则) 基本材料条件： 质粒：(1952) 酶：DNA ligases(1967)，RE(1970) 转化：CaCl2感受态制备(1972) 首个重组DNA分子(1972) Sanger测序(1977)，PCR(1983),首个人工重组DNA分子,重组DNA技术不断发展,1977年 美国博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建

12、造首家利用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。 1980-1990年 转基因小鼠，基因敲除小鼠 1986年英国科学家魏拉德森首次利用细胞核移植法克隆出一只羊 2013年 CRISPR/Cas9基因编辑技术 中国在1982年已用基因工程方法培育出生产干扰素的大肠杆菌新菌种，它产生的干扰素跟天然干扰素一样具有抗病毒活性。,刘兴汉教授博士生导师,曾在中央电视台新闻联播等多家媒体报道。经定点诱变的基因重组内皮抑素在保持原有的抑制新生血管生成活性的 基础上，增加了直接抑制肿瘤细胞生长和迁移的活性。体外抑瘤实验抗肿瘤活性增加了6倍，肿瘤细胞迁移抑制率提高了21个百分点；裸鼠体内抑瘤实验用药21 天抑瘤率提高1

13、1个百分点。属源头创新，具有自主知识产权，已申请国家发明专利。目前有关肿瘤抑素和TAT-凋亡素的研究也已取得突破性进展。,Genetic engineering,Recombinant DNA Technology seems omnipotent 重组DNA技术无所不能,Changing inheritable character,Changing genetic material,幽灵走上餐桌了吗转基因食品,目的： 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,DNA克隆,一、重组DNA技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶

14、碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶,重组DNA技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子内部的特异序列, 并裂解磷酸二酯键。,+,Bam H,定义：,分类：,、 、 （基因工程技术中常用型）,1970, Hamilton O. Smith isolated and characterized the first type II restriction enzyme, Hind II, from the bacterium Haemophilus influenzae,Hind

15、 II,II型RE是重组DNA技术中常用的内切酶,细菌如何保护自身DNA免受 限制性内切酶切割？,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,I，III型RE均为复合功能酶，同时具有限制和DNA修饰作用。,限制-修饰系统,组成 限制性内切酶 甲基化酶,作用 构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,命名：,Hin d,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点

16、回文结构(palindrome),切口 ：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,黏端切口,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,同尾酶,来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同裂酶或同功异源酶。,+,Bam H,+,Bst,同裂酶：,限制性内切核酸酶,二、重组DNA技术中常用的载体,定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,载体按功能分为 克隆载体(cloning vecto

17、r) 表达载体(expression vector),克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。,表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,pUC18质粒载体图谱,（一）克隆载体,复制起点 使载体在宿主细胞中进行自主复制，并能使克隆的外源DNA片段得到同步扩增； 选择标志（selection marker） 区分含与不含载体的细胞所必需的，包括抗生素抗性基因、-半乳糖苷酶基因（lacZ）、营养缺陷耐受基因等。 多克隆位点（multiple cloning

18、 sites，MCS） 一段特异性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个RE的单一切点，可供外源基因插入时选择。,1. 克隆载体应具备的基本特点 ,说明基因工程中互补筛选的原理,载体中有-半乳糖苷酶基因的N端编码序列（片段）； 受体细胞含有-半乳糖苷酶基因的C端编码序列，其N端缺失； 在载体的片段中插入目的基因，将重组体导入受体细胞，在-半乳糖苷酶底物X-gal的培养基中培养宿主菌； X-gal在-半乳糖苷酶作用下生成深蓝色产物； 含有目的基因的受体菌片段被破坏，无酶的活性，X-gal不能分解，是白色菌落； 空载体菌有完整的片段，转入受体菌产生有活性的酶，X-gal能分解，是蓝色菌落。,（1）质粒 (plasmid),特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。,2. 常用的克隆载体,pBR322 Plasmid,噬菌体DNA改造系统 gt系列（