及蛋白质操作技术

1、5.分子生物学研究方法(一)脱氧核糖核酸、核糖核酸和蛋白质操纵技术，5.1重组脱氧核糖核酸技术评论，5.2基础脱氧核糖核酸操纵技术，5.3基础核糖核酸操纵技术，5.4单核苷酸多态性理论和应用，5.5基因克隆技术，5.6蛋白质组和蛋白质组学技术，5.1重组脱氧核糖核酸技术评论，分子生物学的三大成就：遗传信息的载体在20世纪40年代得到确认；脱氧核糖核酸的双螺旋结构模型和半保守复制机制是在20世纪50年代提出的；20世纪60年代，“中心法则”和算子理论被提出，遗传密码被破译。重组脱氧核糖核酸和核苷酸序列分析技术促进了分子生物学的发展。重组脱氧核糖核酸的核心是在体外用限制性内切酶和脱氧核糖核酸连接酶

2、切割和连接脱氧核糖核酸分子。限制性内切酶(RE)是一种能够识别DNA上特定碱基序列(48bp，回文结构)并在识别位点或其周围切割双链DNA分子以产生具有粘性末端或扁平末端的片段的内切酶。第一个字母取自产生这种酶的细菌的名字，用斜体表示。第二个和第三个字母是细菌的名字，用小写字母斜写；第四个字母代表植物，小写；用罗马数字表示发现的顺序。限制性内切酶的名称hin d，流感嗜血杆菌d株的第三种酶，re的活性单位(1 U)，是在50l反应溶液中于37完全分解1g DNA 1小时所需的酶量。稀土浓度为520微克/升.星形(星号)活性：在非最佳反应条件下(高酶浓度、高甘油浓度、低离子强度、高酸碱度等)。)

3、，一些稀土元素可能会切断与原始识别序列不同的位点，这称为星活性。储存方法：保存在-20的50%甘油缓冲液中，避免冷冻。脱氧核糖核酸的酶消化反应1)建立反应体系2)轻轻拍打外壁使其混合均匀，然后快速简单地离心使液体下沉。3)将混合好的反应物放入37度水浴中反应1-3小时。4)酶消化结果通过电泳观察。TaKaRa(鲍生物工程股份有限公司)限制性酶缓冲液组合物(DTT)，二硫苏糖醇，TaKaRa双酶缓冲液使用表，DNA连接酶：通过合成相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，修复缺口或催化粘附而完全分离的两个DNA片段。类型：大肠杆菌脱氧核糖核酸连接酶，噬菌体T4脱氧核糖核酸连接酶。连接反应1)建立反应体系，轻轻

4、摇动外壁使其混合均匀，并快速离心一段时间使液体下沉。2) 4或16结扎过夜。在获得由外源DNA片段和载体分子组成的杂交DNA后，应通过细菌转化将重组载体导入宿主细胞(大肠杆菌)中，以使重组载体能够增殖。通过电泳获得并回收目的基因片段。DNA重组过程、5.2 DNA基本操作技术、5.2.1核酸凝胶电泳技术、5.2.2细菌转化和目标DNA分子的增殖、5.2.3聚合酶链式反应技术、5.2.4实时定量聚合酶链式反应、5.2.5基因组DNA文库构建、5.2.1核酸凝胶电泳技术，原理：当某一分子置于电场中时， 它会以一定的速度移动到合适的位置。迁移率：这种分子在电场作用下的迁移速度与电场强度和电泳分子携带

5、的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数(分子大小、极性和介质粘度的函数)成反比。 流动性取决于分子的大小和构型。分子量越大，流动性越小。相同分子量的超螺旋环状基因、线形基因和开环基因的迁移率。类型：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻的产物琼脂中提取。电泳介质将通过加热琼脂糖粉末至熔点，然后冷却并固化而形成，其密度由其浓度决定。聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺单体和交联剂亚甲基双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和促进剂TEMED的作用下聚合而成的合成凝胶。凝胶的分辨率与凝胶的类型和浓度有关。琼脂糖凝胶的分辨率范围为0.2-50kb。为了分辨较小的DNA片段，应该使用聚丙烯酰胺凝

6、胶，分辨范围是1-1000个碱基。凝胶浓度影响其孔径大小。浓度越高，孔隙越小，分辨率越强。电泳缓冲液：TAE，热塑性弹性体，三丁基锡化合物，功能：稳定体系的ph值；使溶液具有一定的导电性；乙二胺四乙酸可以螯合Mg2，抑制脱氧核糖核酸酶活性，防止Mg2与核酸沉淀。样品装载缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液。功能：增加样品密度；给样品上色；游泳速度是可以预测的。标记：不同分子量的脱氧核糖核酸片段就像一把尺子。步骤：封胶板，插梳混胶，向凝胶中加入EB胶，然后拉梳，放入电泳槽中，加入缓冲液，加入样品，插电极电泳，取胶，观察拍照，仪器设备：电泳槽、电泳仪、紫外分析仪(凝胶成像系统)。在琼脂糖凝胶

7、电泳中，加入适量溴化乙锭染料。EB是一种扁平分子，可以插入核酸分子的相邻碱基之间，在波长为300纳米的紫外线照射下发出荧光。荧光强度与脱氧核糖核酸片段的大小成正比。聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后用硝酸银染色。银首先与核酸形成一个复合物，然后它被还原成带有甲醛的银颗粒，甲醛是深棕色的。脉冲场凝胶电泳。脉冲电场凝胶电泳分离50kb的DNA分子。当两个方向交替的电场施加到凝胶上时，DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而变化，重新取向时间小于电场变化周期的DNA分子将根据其大小而被分离。可以分离多达107个的脱氧核糖核酸分子，用于基因组研究、克隆和分析大的基因片段。5.2.2细菌转化和目标脱氧核糖

8、核酸分子的增殖。细菌转化指的是细菌菌株捕获外源基因并导致其性状发生遗传变化的过程。进入宿主细胞的外源性DNA在载体上被Ori复制和增殖，因此它可以保留在宿主细胞中，并以完整的形式从细胞中分离和纯化出来。细菌在正常情况下只能获得少量的脱氧核糖核酸。为了有效地转化，必须对受体细菌进行物理和化学处理，以提高它们获得脱氧核糖核酸的能力。处理过的细胞被称为感受态细胞。CaCl 2法是制备感受态细胞最常用的化学方法。在大肠杆菌低温预处理的氯化钙溶液中，细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，容易粘附外源基因。转化方法：氯化钙法(热震法)和电击法。热休克法：大肠杆菌感受态细胞在冰42上短暂受热刺激，外源基因被细胞吸

9、收。电击法：使用电融合仪，大肠杆菌电极杯，12.5-15kV/cm，5毫秒电脉冲可在细胞膜上产生孔洞，培养基DNA可通过孔洞进入细胞质。将转化细胞在选择性培养基上培养，筛选出含有外源基因分子的阳性克隆。筛选方法：抗生素筛选和蓝白色斑点筛选。抗生素筛选原则：在质粒上使用抗生素抗性基因。蓝白色斑点筛选原理：载体携带lacZ基因，编码肽链为半乳糖苷酶的氨基端，宿主细菌编码羧基端，细菌和质粒编码的片段无酶活性，片段互补形成活性半乳糖苷酶。互补性：肽链与半乳糖苷酶突变体互补，没有正常的氨基末端。5.2.3聚合酶链式反应技术是聚合酶链式反应的英文缩写，中文译名为聚合酶链式反应，是一种体外快速扩增DNA的技

10、术。凯利穆利斯，原理：类似于体内复制过程的脱氧核糖核酸。模板双链，高温变性-低温复性(退火)-中温延伸是一个聚合酶链反应循环。每个周期持续约24分钟，23小时内可获得数亿份待扩增片段。1)模板：基因组DNA、片段、c DNA、质粒、1pg1g 2)引物：与模板互补的寡核苷酸，开始新链合成，0.11mol/L 3)酶：DNA聚合酶(Taq酶)4) dNTP:标准浓度200mol/L 5)Mg2:0.5-2.5mol/L，引物由软件设计，常用引物premier5.0。设计原则长度：常用18-24nt；气相色谱含量：40-60%；引物中没有互补序列，引物之间也没有互补。引物与非扩增区域没有同源性；3

11、-末端不能被修饰，5-末端可以添加酶切位点。上游引物：5-acacagccacggtccagac-3下游引物：5-atctagccagacggg-3，引物合成：生物公司，干粉溶解，分离：Thermus aquaticus，温泉，黄石国家公园，美国，1969年。分子量为94KDa，含832个氨基酸。良好的耐热性；Mg2依赖性；没有校正功能，误差率为每周期210-4个核苷酸。聚合速度为12kb/min。具有与模板无关的聚合活性。反应条件1) 94预变性510分钟；2) 94变性3060秒；3)4560复性3060秒；4) 72延长至6090s；5) 72延长510分钟；6) 4终止反应。结果：凝胶

12、电泳检测。阳性对照：用于检测聚合酶链反应的效率，以阳性质粒或脱氧核糖核酸为模板。阴性对照：用于检测是否有脱氧核糖核酸污染。反应中不加入模板，通常用水代替模板。在反应中可能出现的问题中没有假阳性扩增带：在设定的对照中出现非特异性扩增带。在平台效应聚合酶链反应中，当引物模板与Taq酶的比例达到一定值时，Taq酶催化的反应趋于饱和，出现平台效应(平台期，停滞效应)，即反应产物不再增加。平台效应的出现时间取决于许多因素，如初始模板量、扩增效率、酶活性、dNTP浓度、引物质量等。后果：非特异性产物增加。5.2.4实时定量聚合酶链反应需要检测特定基因的表达水平。定量聚合酶链反应常用于以标准品为对照来估计特

13、定靶核酸分子的相对含量。因为聚合酶链反应扩增是以指数方式进行的，所以一个循环中扩增效率的微小差异会导致最终产物总量的巨大差异。扩增产物总量的变异系数可达10-30%，因此用简单的方法定量扩增产物是不可靠的。实时定量聚合酶链反应技术：利用带有荧光检测的聚合酶链反应仪，绘制扩增过程中扩增产物积累速率的动态变化图，实现扩增产物的定量分析。在反应中引入荧光化学物质，随着反应的进行，产物不断积累，荧光信号强度成比例增加。每个循环后，采集一个荧光强度信号，通过荧光强度的变化可以监测产物量的变化，从而得到荧光放大曲线。非序列特异性荧光探针：SYBR Green特异性结合靶序列的荧光探针：TaqMan探针，5

14、20纳米激发光，三个元素：5末端短波长荧光基团，靶DNA特异性序列(50-150 BP)，3末端长波长荧光基团，结果分析：设置阴性对照和4个以上标准样品，每个样品重复3次。10-15个周期的荧光值或阴性对照的荧光值的最高点被用作阈值或基线。Ct值：当产品的荧光强度首次超过阈值时，聚合酶链反应所需的循环次数。通过实时定量聚合酶链反应，可以定量比较野生型(正常品种)和突变型的基因表达变化。野生型拟南芥中WUS基因的平均Ct值：31 . 230 . 32；突变体的平均Ct值：21 . 920 . 13；差异Ct:9 . 310 . 19；将聚合酶链反应扩增效率设定为1.8；突变型与野生型的WUS基因

15、表达丰度之比为1.8-1.8CT=23926.25，5 . 2 . 5；基因组文库的构建包含基因组中所有序列的克隆的集合称为基因组文库。用途：分离特定基因片段，分析特定基因结构，研究基因表达调控，构建w基因组文库应该是代表性的和随机的。文库中所有克隆携带的DNA片段必须覆盖整个基因组。采用两种策略：(1)通过机械切割或限制性内切酶切割随机断裂DNA，以保证克隆的随机性；增加文库中重组克隆的数量，从而提高基因组覆盖的次数。预测完整基因组文库中包含的克隆数，用公式：N=ln(1-p)/ln(1-f) N表示基因组文库中包含的重组克隆数；p代表文库中预期靶基因的频率；f代表重组克隆的平均插入长度与基

16、因组总长度之比。最常用的方法是噬菌体载体和限制性酶部分消化。Sau3A可识别4个核苷酸，用于切割基因组，这是与BamH相同的尾酶。酶切产生的片段可以插入到BamH消化的载体中，形成嵌合分子。体外包装后，用重组噬菌体感染大肠杆菌，产生噬斑并形成基因组文库。噬菌体文库的构建方法简单高效，获得的文库可通过分子杂交进行筛选，广泛应用于细菌、真菌等基因组较小物种的研究。高容量克隆载体：科斯质粒(45kb)；细菌人工染色体(BAC)、P1衍生人工染色体(PAC)和酵母人工染色体(YAC)可含有700-1000kb的外源片段，可用于基因组作图、基因组测序等。5。DNA，RNA和蛋白质操作技术，5.1 REv

17、iew重组DNA技术：Re，连接酶5.2 DNA操作技术：核酸凝胶电泳，细菌转化，聚合酶链反应，实时定量聚合酶链反应，文库构建，5.3 RNA基本操作技术，真核生物基因组庞大，含有大量重复序列，很难分离出靶基因；由基因反转录产生的CDNA通常用于文库构建，它代表了包含在mRNA中的基因信息，避免了对RNA分子的困难操作。一个高质量的基因文库代表了生物体器官或组织中包含的所有遗传信息。5.3基本核糖核酸操作技术，5.3.1总核糖核酸的提取，5.3.2核糖核酸的纯化，5 . 3 . 3 cdna的合成，5 . 3 . 4 cdna文库的构建，5.3.5基因文库的筛选，5.3.1总核糖核酸的提取。细胞中的总核糖核酸包括核糖核酸、核糖核酸、核糖核酸、核糖核酸等5.3核糖核酸仅占核糖核酸酶抑制因子的总量：焦碳酸二乙酯(DEPC)，一种蛋白质变性剂，用于灭活溶液和器皿中的核糖核酸酶。在室温下用浓度为0.1%，37处理1小时或过夜，用高压蒸汽灭菌以除去DEPC并水解成CO2和乙醇。5.3.1总核糖核酸的提取方法：异硫氰酸胍-苯酚提取法。三唑试剂是一种提取核糖核酸的特殊试剂，可以破坏