实验11 微生物培养基的配制和灭菌

1、实验 1-1（主要自学）,微生物培养基的配制和灭菌,一、实验目的,了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。 掌握加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。,微生物培养基的配制和灭菌,二、实 验 原 理,1、培养基：是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养料。 2、培养基营养成分：碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。,营养物质的浓度要适宜 营养物质之间的配比要适宜,培养基的pH值、渗透压、水活度和氧化还原电势等物理化学条件要适宜。,3、培养基的种类 （1）培养基按成分可分为：天然培养基、合成培养基和半合成培养基。 （2）按用途可分为：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基和选择培

2、养基等。 （3）按物理状态可分为“固体培养基、半固体培养基和液体培养基 。,二、实 验 原 理,按照培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基。 3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.5%凝固剂而成的半固体状培养基。,3、培养基的种类,细菌： pH 7.08.0 放线菌：pH 7.58.5 酵母菌： pH 3.86.0 霉菌：pH 4.05.8 藻类： pH 6.07.0 原生动物： pH 6.08.0,初始pH,4、通常培养条件：,二、实验原理,琼脂是最优良的凝固剂，自1880年开始用于配

3、制微生物培养基以来，至今经久不衰。,5、凝固剂,细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基； 放线菌：高氏1号合成培养基培养； 酵母菌：麦芽汁培养基； 霉菌： 查氏合成培养基；,二、实验原理,6、实验室的常用培养基,称量-配置-调节pH值-过滤-分装-灭菌 1.称量 按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状（如肉膏），应用烧杯称量。,三、培养基配制的基本步骤,2.配调 向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热助溶）。 如是配制固体培养基，在琼脂的熔化时，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。 如果配方中含有淀粉，先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌，

4、然后加足水分及其他药品，待完全熔化后补足所失水分。,三、培养基配制的基本步骤,3.调节pH值 培养基溶解均匀并冷却至室温时用pH试纸测pH，然后根据要求加酸或碱（一般用1molHCl和1molNaOH），要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然pH时，不用调节。 4.过滤 用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。,三、培养基配制的基本步骤,5.分装 将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热装。 分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。分装量可分为下面几方面：（1）斜面：装量为管长的1/4-1/5。（2）液体培养基、高层培养基、半固体培养基：装载量不超过管

5、长的1/3。（3）三角瓶：装量不超过容积1/2。,三、培养基配制的基本步骤,分装后，塞棉塞（胶塞），包扎，灭菌。（1）培养基的灭菌 常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌、常压间歇式灭菌超高温灭菌、过滤除菌、辐射灭菌、化学药品灭菌等方法。 本实验培养基的灭菌常使用的是高压蒸汽灭菌，它是利用高温湿热空气使菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的。,6. 灭菌,三、培养基配制的基本步骤,高压蒸气灭菌条件： 一般培养基: 1.05 Kg/cm2, 121.3, 15-30 min 含糖培养基: 0.56 Kg/cm2, 112.6 , 15-30 min,（1）培养基的灭菌,6. 灭菌,（2

6、）器皿的灭菌：干热空气： 160， 2 小时 （3）无菌室的消毒 紫外光 化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾+甲醛）,6. 灭菌,6. 灭菌,湿热灭菌使用的设备,（4）,加水装锅盖盖加热当压力升为0.5kg/cm2时排放冷空气正式升压保压（1.1kg/cm2，121，保持20-30min）停止加热自然降压至零排放余汽开盖取出灭菌物品趁热摆斜面检验灭菌效果。,（5）灭菌的操作过程,牛肉膏蛋白胨培养基的配制,1、固体培养基（平板制作） 2、固体培养基（斜面制作） 2、半固体培养基 3、液体培养基,四、几种培养基的配置方法,牛肉膏蛋白胨固体培养基配方： 牛肉膏 0.3g 蛋白胨 1g 氯化钠 0.5g 琼

7、脂 1.5g 水 100mL pH 7.2-7.4 灭菌 121，20min,牛肉膏蛋白胨半固体培养基配方： 琼脂 0.3g,牛肉膏蛋白胨液体培养基配方： 琼脂 0g,四、几种培养基的配置方法,1.按配方称取一定量的试剂、琼脂到250ml的 三角瓶中。 2. 加入100mL水。 3.塞上硅胶塞,用牛皮纸包扎好。 4.高压蒸汽灭菌。 5.灭菌后,当培养基冷却至50左右时,无菌倾注平皿(每100ml可制备5-6个平皿)。 6.凝固后放冰箱备用 。,（一）平板固体培养基制作,（二）斜面培养基制作,1.称取一定量的营养琼脂到100ml的三角瓶中。 2. 加入100mL水。 3. 放入水浴锅内溶解。 4

8、. 在空试管内倒入23mL已经溶解好的培养基， 【注意尽量不要让培养基沾到试管口】塞好硅胶塞。 5.放入烧杯中,高压蒸汽灭菌。 6.摆斜面,凝固后放冰箱备用。,用于活化菌种， 或培养菌种的斜面,用于保存菌种的斜面,搁置斜面 当培养基冷却至50左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的一半。,半固体培养基制作,1.按牛肉膏蛋白胨半固体培养基配方称取相应成分到250ml的三角瓶中。 2. 加入100mL水。 3. 放入水浴锅内溶解。 4. 在空试管内倒入23mL已经溶解好的培养基， 【注意尽量不要让培养基沾到试管口】塞好硅胶塞。 5.放入烧

9、杯中,高压蒸汽灭菌。 6.凝固后放冰箱备用。,牛肉膏蛋白胨半固体培养基配方,牛肉膏: 0. 3g 蛋白胨: 1g NaCl: 0.5g 琼脂: 0.3g 水: 100ml pH: 7.0-7.2 放入水浴锅内溶解后,分装到试管中,灭菌备用。,液体培养基制作,1.按牛肉膏蛋白胨液体培养基配方称取相应成分到250ml的三角瓶中。 2. 加入100mL水。 3. 充分溶解。 4. 在空试管内倒入23mL已经溶解好的培养基，【注意尽量不要让培养基沾到试管口】塞好硅胶塞。 5.放入烧杯中,高压蒸汽灭菌。 6. 冷却后放冰箱备用。,牛肉膏蛋白胨液体培养基按下列配方及方法配制,牛肉膏: 0. 3g 蛋白胨: 1g NaCl: 0.5g 水: 100ml pH: 7.0-7.2 放入水浴锅内溶解后,分装到试管中,灭菌备用。,注：试管加棉