分光光度法检测蛋白质含量.ppt

1、a，1，生化和分子生物学实验，曾季平生化和分子生物学系，a，2，生化和分子生物学实验，实验室规则实验室安全和防护实验室常用的玻璃仪器实验，a，3，实验室规则，5分钟前去实验室不允许要不得、迟到、早退、缺勤，迟到、早退1 禁止在实验室吃食品，违反者延误处理。 上课时必须穿隔离服，穿拖鞋和背心要不得。 否则禁止进入实验室。 实验期间必须将大哥大设置在震动中，上课期间请接入紧急，打电话后请在走廊处理。 在实验室必须保持安静，有喧哗，有高声地说话，有使不得。 认真预习实验，养成良好的实验习惯(实验中、实验结束后)，a，4，实验室安全与防护，火灾预防中毒外伤，a，5，实验室常用玻璃器具，吸管* (示范)

2、试管烧杯的量测仪器，a，6，实验，实验课成绩平时， 表达实验测试原理的实验报告-格式结果操作试验分析，a，7，实验报告采用网上提交的方式，实验报告提交时间设定为3天，在本次实验结束的第二天下午1.2前提交，到期不能提交。 这次的实验报告书设为0分。 早点提交报告书，不要等到截止日期。 因为系统不稳定，有不能提交的事情。 将通讯端口直接粘贴到盒子上。 请不要用附件上传。 文件可能无法打开，可能会影响成绩。 不要互相模仿，发现雷和卷为0分。 如果截止日期没有提交报告书的话，把报告书发送到老师的邮箱里要不得，发送也没用。 最终实验报告的成绩只记录系统导出的成绩。a、8、实验一、分光光度技术和蛋白质含

3、量测定、a、9、 掌握理论分光光度技术的基本原理了解分光光度计的基本结构实验：利用分光光度技术进行蛋白质含量测定1 .用双尿素法测定蛋白质含量2 .用kamur slun键法测定蛋白质含量3 .用紫外分光光度法测定蛋白质含量应用：定性定量优点：灵敏度高，精度高，操作简便快捷，分光光度技术(Spectrophotography )，a，1.1，2，工作原理物质对光线有选择性吸收作用。 每种物质都有其特征性的吸收谱。 在一定的条件下，物质对光的吸收程度与该物质的浓度成比例。 分光光度法中使用的光谱范围： 200nm10200nm400760nm76010m紫外光区可见光区使用红外光区、a、1.2，

4、用吸收谱曲线鉴定化合物，吸收谱曲线：以波长不同的单色光为入射光，测定某溶液的吸光率，以波长为横轴，吸光率为纵轴每种物质都有其特征性的吸收谱，可以作为定性分析的依据。 吸光率、a、1.3、1 .兰伯特定律在单色光可通过光吸收介质时，其光强随光吸收介质厚度的增加呈指数减少。 按照I1/I0=e-K1l 2.比尔(Beer )法则，单色光通过光吸收介质时，其光强随光吸收介质浓度的增加而指数减少。 I1/I0=e-K2C I0 :入射光强度； I :的透射光强度l :介质厚度c :介质浓度，如何进行定量？ Lambert-Beer定律*、a、1.4、3.Lambert - Beer定律*、单色光通过某

5、一溶液时，光被溶液吸收，吸收量与溶液的浓度和溶液的厚度成正比。 A=CL A :吸光率c :溶液浓度l :液晶层的厚度：即，摩尔消光系数是指在一定波长下溶液的浓度为1 mol/L、光路长度为1cm时的吸光率值。 *波长、溶液、温度固定时，由物质的特性决定。 在a、1.5、4 .计算* (1)标准管法(标准比较法)的实际测量过程中，使用已知浓度的测量物与测量管同样地处理显色，读出吸光率，根据上式进行化学基计算。a标准=标准c标准l标准a样品=样品c样品l样品a :吸光率：摩尔吸光率； c :溶液浓度l :液层厚：a、1.6、参比溶液和样品液中的溶质是相同的物质，由于样品=参比溶液和测定液的比色杯

6、径相同的l样品=L标准，所以上二式为a标准/A样品=标准c标准l标准/样品c样品l样品c样品=A样品(2)标准曲线法制备标准绘制曲线：已知不同浓度的测定物溶液，用与测定管相同的方法处理显色，读取各管的吸光率。 以溶液浓度为横坐标，吸光率为纵坐标，在方格坐标纸上形成了定标曲线。 取得样品的浓度：根据测定的样品的吸光率值从定标曲线取得测定物的浓度。a、1.8、定标曲线使用注意事项、定标曲线范围为测量浓度的一半至2倍之间。 吸光率在0.051.0的范围内。 制作的定标曲线只在短期内使用。 制作定标曲线和测量管时，请使用相同的机器进行测量，以免发生误差。a、1.9、5应用中注意到的问题* Lamber

7、t-beers law的偏差：该定律只适用于一定的浓度范围，a应在0.051.0之间的选择波长：最大吸收波长a .灵敏度b .防止杂质干扰作用参照溶液(空白管) :背、a、2.0、空白对照管：在测定中，由于比色皿自身和溶剂也会产生一定的光吸收，因此测定的溶质以外的成分设置在完全相同的空白对照管中。 测量时，首先用空白对照管将光路对准，使机器为零，消除比色皿自身对光的吸收，消除非测量物对光的吸收，测量值为测量物对光的吸收。a、2.1、分光光度计(spectrophotometer )、基本零配件、a、2.2、a、2.3、2、分光光度计使用顺序(示教) 3、使用时的注意事项* 1.波长选择。 2

8、.机器的预热。 3 .不测量时，请使样品室的盖子处于打开状态。 不那样做的话，光电管会累的。 4 .将变成腐食性液体的比色皿放置在机器表面要不得。a、2.4、5 .比色盘的使用上的注意*紫外光不能透过玻璃比色盘，因此在紫外光区的测定中使用灰水晶比色盘。 同组使用的比色皿必须定径套(规格、新旧程度一致)。 比色盘有两个光面和两个毛面，光学面对光路，没有污损。 不那样做的话会引起光吸收的增加。 a、2.5、比色皿中的溶液过少则要不得，过多则要不得。 一般加入的液体约占容积的2/3。 将腐食性溶液长期放入比色皿中要不得。 每次使用时，请立即清空，或用吸引泵吸取后，用水3.4洗比色盘。 *在这次实验中

9、，考马斯布莱特蓝将玻璃色的碟子着色，并将酒精浸泡清洗。a、2.6、蛋白质量化分析实验、实验单缩聚尿素法测定蛋白质含量(p50 )实验三考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量(p52 )实验四紫外分光光度法测定蛋白质含量(p53 )、a、2.7、实验单缩聚尿素法测定蛋白质含量， (基本原理)蛋白质分子含有多种肽键，与双缩合尿素结构类似，在盐化学基性溶液中能与铜络离子结合成紫色的化合物(称为双缩合尿素反应)。 在一定的浓度范围内，颜色的浓淡与蛋白质的浓度成比例，所以可以用比色法测定蛋白质含量。 由于含有2个以上的肽键的物质发生这种反应，所以氨基酸没有这种反应。 尺缩二脲的灵敏度为1-20mg。 (1)定标

10、曲线的制作取6根试管，编号如下表所示进行操作，2混合后，在3.7水浴中放置1.5分钟，用540nm波长进行颜色比较，第6管调整为零，测定各管的吸光率值。 将各管的吸光率值作为纵坐标，蛋白质浓度作为横坐标进行绘制曲线。 a、2.9、(二)样品测定：样品0.1ml，生理盐溶液0.9m1，再加入缩二脲试剂4m1，在3.7水浴中放置1.5分钟测定其吸光率，并根据吸光率值测定定标曲线，计算样品中蛋白质浓度。注意：双缩二脲法的灵敏度为1-20mg，提取蛋白参比溶液时留心为浓度。 实验时，样品管可以处理标准管和云同步，a、3.0、【基本原理】G-250有两种不同的颜色形式，即红色和蓝色。 这与蛋白质通过范德

11、瓦尔斯力结合，与蛋白质结合的颜色从红色变为蓝色，最大吸收峰从465nm变为595nm，通过测定595nm时光吸收的增加量可知结合蛋白质的量。 优点：灵敏度高，1-5g测定速度快，干扰物质少。 用实验三考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量，a、3.1、1取3根试管，编号为下表所示的操作试剂(ml )空白对照标准样品生理盐溶液0.1蛋白参比溶液(50ugml) 0.1样品0.1考马斯亮兰试剂5.0 5.0、2 .混合，放置5分钟，以波长595nm空白对照鞠躬(操作步骤)，a，3.2，3.a标本/A标准50 (g/ml)=样品中蛋白质含量(g/ml )计算注意：蛋白质参比溶液浓度50 g/ml，a，3.3

12、，实验四紫外分光光度法测定蛋白质含量【基本原理】蛋白质分子含有酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸由于各种蛋白质所包含的芳香族氨基酸的量较少，因此在该波长范围内，吸收峰的光密度值与其浓度成比例，可以进行定量测定。 灵敏度： 50-100g，a，3.4，【操作顺序】，(1)制作定标曲线1 .取出6根试管，进行编号，操作如下表。 试剂(ml) 1 2 3 4 5 6标准蛋白质溶液0.5.0.1.5.2.0.0.5.0生理盐溶液3.5.02.5.0混合入灰水晶杯，用紫外分光光度计测定波长280nm各管的光密度，绘制各管的光密度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标的标准格拉夫。 (二)标本测定：取标本1.0ml，加入生理盐溶液3.0ml，测定a80标准线上浓度。 因、a、3.5、颈椎脱臼而处死小鼠，切开腹部，取出肝脏组织，放入培养皿中用PBS清洗。 取100mg肝组织，破碎，转入匀浆机。 将1mL预冷的裂缝