登革热实验室检测#专业知识

1、登革热实验室诊断技术及评价,病毒病预防控制所 李建东,1,专业精制版,内容概述,检测指标及动态变化 检测策略 抗原检测 病毒分离 核酸检测 抗体检测 常用检测试剂比较,2,专业精制版,登革病毒实验室检测指标,诊断标记,RT-PCR,NS1： 膜相关NS1，mNS1 分泌型NS1，sNS1 发病第1-9天出现 病毒血症期必然出现的分子标识物 可高达50g/mL,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,3,专业精制版,登革病毒首次感染,PLoS Negl Trop Dis 5(9): e1309.,4,专业精制版,登革病毒再次感染,PLoS Negl Trop Dis 5(9): e130

2、9.,5,专业精制版,6,专业精制版,7,专业精制版,合适的时机采用合适的检测方法,世界卫生组织登革防控指南2009,8,专业精制版,登革实验室检测方法特点及费用,世界卫生组织登革防控指南2009,9,专业精制版,登革实验室检测方法优缺点,世界卫生组织登革防控指南2009,10,专业精制版,早期检测宜用PCR、NS1，发病5天后宜采用抗体检测,Kappa coefficient PCR=0.72 NS1 ELISA=0.81 NS1Rapid=0.77,11,专业精制版,不同检测方法的精确性,12,专业精制版,NS1抗原检测,3种商业化检测试剂盒 PanBio（Inverness)-ELISA

3、&Lateralflow Rapidtest（strip） Platelia（BioRad)-ELISA&Lateralflow Rapidtest（strip） SD Bioline-Cassette 万泰？ ？,阴性检测结果不能排除近期感染 孕妇和携带类风湿因子的患者常可出现假阳性结果,13,专业精制版,适用于多种标本,临床标本 急性期全血、血清或血浆，脑脊液（0-5天） 4-8保存不超过2天 长时间保存-70 以下或干冰 尸检组织标本应立即保存于-70 以下或干冰,疫情暴发地区的蚊虫媒介,14,专业精制版,适用于所有血清型，首次感染更敏感,15,专业精制版,尸检组织标本的NS1抗原检测,

4、PLoS Negl Trop Dis 2011, 5:e1147,16,专业精制版,蚊媒标本中NS1抗原检测,Lab infected mosquitoes:95.8%,Field caught mosquitoes:,17,专业精制版,PCR,污染问题：敏感性增加，污染风险加大，套式PCR增加污染风险，实时定量RT-PCR污染风险降低，阴性对照为阴性不能排除污染的风险。 防RNA酶 内对照、定量分析 特异性敏感性主要取决于引物、探针,18,专业精制版,核酸检测流程图,反应体系混合物 正、反向引物混合物 特异性荧光探针,1) 核酸分离,2) Real-time PCR 检测,20 l,5 l,

5、反应条件取决于病原体特异性,PCR仪,合适的PCR管,19,专业精制版,病毒分离,敏感性,20,专业精制版,病毒分离的流程,蚊媒匀浆或血清； 加入细胞培养管或瓶； 37吸附1小时，每15分钟轻轻摇动一次； 补液； 33 孵育3-7天，每日或隔日观察CPE； IFA检测，传代，IFA检测。单抗检测分型。,21,专业精制版,病毒分离影响因素：标本采集、保存和运输，分离方法，病毒型别、载量，患者免疫反应等,22,专业精制版,检测抗体,中和实验 通过将血清与病毒混合，接种微量板内单层细胞，检测抗体对病毒感染性的影响。 检出中和抗体可确定存在登革病毒保护性免疫。 是唯一分型检测IgG抗体的方法。 微量中

6、和实验,23,专业精制版,登革病毒首次与再感染特异性抗体动态变化,24,专业精制版,检测抗体,血凝抑制实验 免疫荧光法 酶联免疫法：间接法、抗体捕获法、抗原捕获法,间接法,抗体捕获法,抗原捕获法,25,专业精制版,7种ELISA检测方法的精确性和敏感性比较,26,专业精制版,6种检测试剂的特性及交叉反应,27,专业精制版,6种检测试剂的精确性和敏感性,28,专业精制版,实验室检测结果解释,世界卫生组织登革防控指南2009,登革热诊断标准 WS216-2008,单一标本的IgM抗体检测结果不能作为确诊依据。双份血清（间隔7-14天）抗体阳转，抗体滴度4倍或以上升高可以确诊（WHO） IgM抗体阳性提示急性或近期感染（通常90天），但单一标本的IgM抗体检测阳性结果不能确诊 阴性结果不能排除登革病毒感染 类风湿因子等存在是可发生交叉反应，也可与其他黄病毒发生交叉反应 20-30%继发感染病例，检测不到IgM抗体。,确诊：,29,专业精制版,首次感染与再感染辨别,Dengue IgGcapture ELISA,30,专业精制版,新检测试剂盒,Assure Dengue IgA SD Bioline Duo：NS1-IgM-IgG,31,专业精制版,32,专业精制版,33,专业精制版,34,专业精制版,35,专业精制版,E/M,NS1,36,专业精制版,37,专业精