new 第4章 蛋白质的共价结构.ppt

1、2009.7.29,0,第4章 蛋白质的共价结构,一、蛋白质通论 二、肽 三、蛋白质一级结构的测定 四、蛋白质的氨基酸序列与生物学功能,一、蛋白质通论,（三）蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次,（二）蛋白质的形状和大小,（一）蛋白质的分类,一、蛋白质通论,（一）蛋白质的分类,纤维状蛋白质：fibrous protein，分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。,依据蛋白质的外形分类,球状蛋白质：globular protein，外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。,依据蛋白质的组成分类,结合蛋白(conjugated protein

2、),简单蛋白(simple protein),单纯蛋白质：这类蛋白质只含由-氨基酸组成的肽链，不含其它成分,清蛋白和球蛋白 albumin and globulin,硬蛋白,由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成,色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。 糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。 脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。 如血清-，-脂蛋白等。 核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。,（二）蛋白质的形状和大小 纤维蛋白质、球状蛋白质,长度/直径10,蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1,000,000道尔顿甚

3、至更大。,（二）蛋白质的形状和大小,蛋白质和多肽（polypeptide)有时是不加区别的，但一般来说，多肽分子量小，在10,000以下，而蛋白质则具有更高分子量,（三）蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次,化学结构（construct,构造 )：是指组成分子的原子种类+数量以及它们之间的键合(化学键)形式,C2H5OH 乙醇CH3OCH3 乙醚,构型(configuration)：在给定的化学结构下，分子中原子在键合时所形成的不同的空间排列 （可分离）,旋光异构 顺反异构,构象(conformation)：在化学结构和构型相同的分子中，其原子由于单键的内旋转(internal totation)

4、而在空间形成的不同的构象体可以相互转化,丁烷 其内部单键数为1 构象数是 3,一种物质它的构造和构型只有一种，但它的构象可以有许多种 ！,蛋白质的结构层次现在一般用： 一级结构、二级结构、三级结构和四级结构 在二、三级结构之间又分出二个亚层次：超二级结构和结构域。,空间结构=三维结构=蛋白质的构象,二、肽,1、肽的基本概念,2、肽命名,3、动植物体内重要的肽,4、肽的物理和化学性质,1、肽的基本概念,一分子氨基酸的-羧基与另一分子氨基酸-氨基脱水缩合的化合物叫做肽，氨基酸之间通过酰胺键（蛋白质化学中将这类酰胺键专称为肽键）连接而成。,指示: 删除样本文档图标,并替换为工作文档图标，如下: 在

5、Word 中创建文档. 返回 PowerPoint 在“插入”菜单中选择“对象.” 单击“从文件创建” 定位“文件”框中的文件名 确认选中“显示为图标”。 单击“确定” 选择图标 从“幻灯片放映”菜单中选择“动作设置” 单击“对象动作”，并选择“编辑” 单击“确定”,肽键性质1：肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 肽键性质2：在大多数情况下，以反式结构存在。,相邻2个氨基酸的侧链R形成反式构型,组成肽键的原子（4+2）处于同一平面肽平面。,二肽：丙氨酰甘氨酸,三肽,谷丙甘氨酸,2、肽命名,寡肽少数几个氨基酸 组成的肽,多肽链、蛋白质就是由几十个到几百个甚至几千个氨基酸分子借肽键相

6、互连接起的多肽链,肽链中的氨基酸不是原来完整的分子，多肽链中的氨基酸单位称为氨基酸残基,多肽化合物的名称，通常按照肽内氨基酸残基的排列顺序，以残基名称（如某某氨酰）从N端依次阅读到C端，并以C端残基全名结束肽的名称。,指示: 删除样本文档图标,并替换为工作文档图标，如下: 在 Word 中创建文档. 返回 PowerPoint 在“插入”菜单中选择“对象.” 单击“从文件创建” 定位“文件”框中的文件名 确认选中“显示为图标”。 单击“确定” 选择图标 从“幻灯片放映”菜单中选择“动作设置” 单击“对象动作”，并选择“编辑” 单击“确定”,由n个-氨基酸缩合而成的肽称为n肽，由多个-氨基酸缩合

7、而成的肽称为多肽。 一般把含100个以上氨基酸的多肽（有时是含50个以上）称为蛋白质。,命名举例,氨基末端,羧基末端,下列五肽命名为：,丙氨酰谷氨酰亮氨酰缬氨酰组氨酸,注意：,在开链肽的N端和C端可以有游离的氨基和羧基，而有的开链肽的N端或C端的游离的氨基或羧基被别的基团结合（如烷基化、酰化等）或N端残基自身环化。,例如促甲状腺素释放激素的N端残基是谷氨酸，此残基易于自身环化成焦谷氨酰基（氨基与谷氨酸的羧基脱水缩和而成）。,无论肽链有多长，在链的两端一端有游离的氨基（-NH2），称为N端；链的另一端有游离的羧基（-COOH），称为C端。,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。

8、但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。 如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,活性肽 激素肽或神经肽,3、动植物体内重要的肽,1）、谷胱甘肽,-肽键,GSH容易氧化，二分子GSH脱氢以二硫键相连成氧化型的谷胱甘肽（GSSG） 谷胱甘肽是某些酶的辅酶，在体内氧化还原过程中起重要作用 ；参与二硫化合物相互转化,2）、催产素和升压素,催产素,升压素 升高血压、抗利尿激素,环状部分参与学习记忆的巩固,直链部分参与记忆的恢复过程,催产素,3）、促肾上腺皮质激素（ACTH）,大脑分泌的ACTH参与意识行为的调控； 腺垂体分泌

9、的ACTH主要作用于肾上腺皮质,4）、脑啡肽,Leu-脑啡肽,Met-脑啡肽,有镇痛作用而又不会像吗啡那样使病人上瘾的药物,吗啡是鸦片中最主要的生物碱（含量约10-15%），1806年法国化学家F泽尔蒂纳首次从鸦片中分离出来。用分离得到的白色粉末在狗和自己身上进行实验，结果狗吃下去后很快昏昏睡去，用强刺激法也无法使其兴奋苏醒；他本人吞下这些粉末后也长眠不醒。据此他用希腊神话中的睡眠之神吗啡斯（Morphus）的名字将这些物质命名为“吗啡”。,脑啡肽（endorphin）亦称內啡肽，是一种内成性（脑下垂体分泌）的类吗啡生物化学合成物激素。它能与吗啡受体結合，产生跟吗啡、鸦片剂一样有止痛和快感。等

10、同天然的镇痛剂。,runners high,1975年，两个小组分别自猪脑和牛脑中发现,5）、胆囊收缩素,胆囊收缩素是一种由33个氨基酸组成的肽,6）、胰高血糖素 29肽,4、肽的物理和化学性质,离子晶体，熔点高，两性离子。 双缩脲反应（biuret reaction）是肽和蛋白质所特有的一个反应。一般含有两个或两个以上的肽键的化合物与CuSO4碱性溶液都能发生双缩脲反应面生成紫红色或兰紫色复合物,利用这个反应可以以分光光度计法测定蛋白质含量（非蛋白质特异性）,肽等电点的计算： 依然是两性离子两侧pK值之和的1/2。,蛋白质分子的一级结构及其测定,一级结构,组成多肽链的氨基酸残基的 连接方式和

11、排列顺序,二硫键,蛋白质的一级结构：,(Primary structure),组成蛋白质的多肽链数目,多肽链的氨基酸顺序,多肽链内或链间二硫键的数目和位置,1，样品必需纯（97%以上）； 2，知道蛋白质的分子量； 3，知道蛋白质由几个亚基组成； 4，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 5，测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,测定蛋白质的一级结构的要求,三、蛋白质一级结构的测定,1.氨基酸组成分析 2.氨基酸末端分析 3.蛋白质中肽链的拆离 4.肽链的部分降解及肽片段的分离 5.肽段氨基酸顺序测定及肽段重叠 6. 二硫键与酰胺基的定位,1.氨基酸组成分析,N-末端分析,

12、C-末端分析,2.氨基酸末端分析,N末端测定方法比C末端更加成熟、可靠和准确，,N-末端分析,二硝基氟苯法（DNFB法）,二甲基氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）,异硫氰酸苯酯法（Edman法，PITC法）,氨基酸末端分析,2.氨基酸末端分析,N-末端分析-化学法、酶法,氨肽酶法,二硝基氟苯法（DNFB法）,1945年由Sanger 发明此法,曾用此方法测 定了胰岛素的 N -末端。,2.氨基酸末端分析,二甲基氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）,1956年 hartley等提出,灵敏度较高 （比FDNB法提高100倍）,样品量小于1毫微摩尔,DNS-氨基酸稳定性较高,2.氨基酸末端分析,异硫氰酸苯

13、酯法（Edman法，PITC法）,2.氨基酸末端分析,生成PTH-氨基酸 非常稳定， 在268nm处有 强吸收峰,C-末端分析-化学法、酶法,肼解法,还原法,羧肽酶法,2.氨基酸末端分析,可与苯甲醛作用形成不溶的二亚苄基衍生物而除去,溶于上清中,肼解法不适宜于C端为胱氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的测定。 肽链中的丙氨酸、丝氨酸以及甘氨酸残基形成的酰肼化合物不稳定，在水溶液中容易转化为原来的氨基酸而干扰结果。,2.还原法,2.氨基酸末端分析,硼氢化锂还原成-氨基醇。完全水解后分析-氨基醇,3.羧肽酶法,主要方法,根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C末端残

14、基顺序。 实际应用时，由于羧肽酶对不同的C末端氨基酸作用的速度不同，而且反应是连续的，不能停在某一步上，因此给正确判断氨基酸的顺序造成了一定的困难。,2.氨基酸末端分析,肽链外切酶,自多肽链的C端逐个的水解氨基酸,4种常用羧肽酶：,羧肽酶A、B均不作用于C-末端第二位为Pro的C-末端的残基的肽键,-AA-AA-Lys,-AA-AA-Arg,-AA-AA-Pro,-AA-AA-pro-AA,羧肽酶A不作用,羧肽酶B只作用,羧肽酶A、B均不作用,羧肽酶Y设计自动化序列仪,return,肽链间的结合,非共价键,血红蛋白（四聚体） 烯醇化酶（二聚体）,共价键结合,胰岛素 免疫球蛋白等,3、蛋白质中肽

15、链的拆离,非共价键连接的多肽链,温和条件下可以解离,通过二硫键连接的多肽链,需要较强的条件将二硫键切断,3、蛋白质中肽链的拆离,拆分,二硫键结构是半胱氨酸残基经氧化作用而形成胱氨酸残基。,还原法,氧化法,3、蛋白质中肽链的拆离,主要二种方法： 1. 过甲酸氧化法,巯基（-SH）和二硫键（-S-S-）同时氧化成磺基，生成的磺酸基很稳定，肽链不再重新形成二硫键，便于肽链分离,二硫桥的断裂,二硫桥的断裂,2. 巯基化合物还原法,蛋白质变性 二硫键暴露,可以用碘乙酸等烷基化试剂保护生成的半胱氨酸的-SH,+,巯基保护试剂,由于氨基酸顺序测定多数采用Edman降解法，它一次能分析肽链长度约10余个氨基酸

16、残基，所以分离得到的单链如果太长，须将长的肽链断裂成易分析的较短肽链。 肽链部分降解的方法要求选择性强、裂解点少、反应率高，一般采用化学裂解和酶解法两种。,4.肽链的部分降解及肽片断的分离,1）化学裂解法 溴化氰（CNBr）与肽链中Met残基侧链的硫醚基发生反应，生成环化的溴化亚氨内酯，此产物水解后，产生高丝氨酸内酯，使蛋氨酸羧基端的肽键断裂。 这一方法的优点是产率高（可达85%）、专一性强，故实际应用较多。,甲硫氨酸,人体唯一的含硫必需AA,其中产生片段的C端是Met,2）酶解法 酶解法相对化学裂解法而言，有许多优点，如专一性强、裂解条件温和、副反应少等，再则蛋白水解酶对肽链的水解率也比较高

17、，而且不同的蛋白水解酶对不同氨基酸形成的肽键水解专一性不同。 因此，酶解法被广泛使用。,胰蛋白酶,胰凝乳(糜)蛋白酶,葡萄球菌V8蛋白酶,胃蛋白酶,溴化氰,梭菌蛋白酶（Arg蛋白酶）,pH2-3,磷酸（pH7.8）,碳酸氢铵（7.8）/醋酸铵（4.0）：Glu,（Glu蛋白酶）,Arg(C),5、肽段的分离提纯 肽链经部分裂解得到肽片段必须分离提纯，才能进一步测定其氨基酸顺序。 先采用凝胶过滤，得到不同相对分子质量的肽片段组分，同时也脱去了样品中的盐类。然后，肽片段组分可用离子交换层析进一步提纯，也可应用双相高压纸电泳和层析相结合的方法，HPLC或FPLC具有更高的分辨率。,6. 肽段氨基酸序

18、列的测定,主要Edman降解法 现在主要由氨基酸序列推定法,7. 肽段在多肽链中次序的决定 重叠肽段拼凑法重建多肽链序列,8. 二硫桥位置的确定对角线电泳,取少量的样品，首先用碘代乙酰胺将肽链中未参与二硫键形成的巯基保护起来，然后用胃蛋白酶水解。 肽水解后，可用Brown和Hartlay提出的对角线法电泳分离。,8. 二硫桥位置的确定对角线电泳,对角线电泳图谱,混合肽段点到滤纸中央，两个方向的电泳条件完全相同,序列分析中的重要方法和技术,测定N-末端基的异硫氰酸苯酯（PITC）法； 分析C-末端基的羧肽酶法； 用于多肽链局部断裂的酶裂解和CNBr化学裂解； 断裂二硫桥的疏基乙醇处理； 测定肽段

19、氨基酸序列的Edman化学降解和电喷射串联质谱技术； 重建多肽链一级序列的重叠肽拼凑法 用于二硫桥定位的对角线电泳等。,蛋白质顺序测定基本战略,例题： 当一种4肽与DNFB反应后，用5.7mol/L HCl水解得到DNP-Val及3种其它AA；当这4肽用胰蛋白酶水解时发现有两种碎片段；其中一片用LiBH4还原后再进行水解，水解液内有氨基乙醇和一种在有浓硫酸条件下能与乙醛酸反应产生紫红色的AA。试问这4肽的一级结构是由哪几种AA组成？,在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生成紫色物质，反应机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相似的物质。,9.蛋白质测序举例,英国Sang

20、er等人在1953年首次完成了牛胰岛素（bovine insulin）的全部化学结构的测定工作这是一个里程碑性的工作,Frederick Sanger 1918,8,13,1958年、1980年两度获得诺贝尔化学奖,A链,B链,过甲酸,产物分离,分离肽片段，测定肽序列,用重叠肽重建多肽链序列,胰岛素中二硫桥位置的确定,由于蛋白质序列测定技术先于DNA序列测定技术问世，蛋白质序列的搜集也早于DNA序列。 60年代中期到80年代初，美国国家生物医学研究基金会(简称NBRF) Dayhoff领导的研究组将搜集到的蛋白质序列和结构信息以“蛋白质序列和结构地图集”(Atlas of Protein Sequence and Structure)的形式发表，主要用来研究蛋白质的进化关系。 1984年，“蛋白质信息资源”(Protein Information Resource，简称PIR)计划正式启动，蛋白质序列数据库PIR也因此而诞生。,10. 蛋白质序列数据库,10. 蛋白质序列数据库,四、蛋白质的氨基酸序列与生物学功能,能告诉