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文档简介

1、肝脏蛋白的提取和浓度测定,医学基础实验室,实验目的,了解掌握考马斯亮蓝法（Braford法）测定蛋白质含量的原理和方法,实验目的,肝脏组织蛋白的提取 蛋白的浓度测定,原理： RIPA裂解液是一种传统的细胞组织快速裂解液，主要裂解成分含1% Triton X-100, 0.5% 胆氧胆酸钠（sodium deoxycholate）, 0.1% SDS，得到的蛋白样品可以用于常规的Western。,1.肝脏组织的提取,操作 步骤,1.肝脏组织的提取,组织取材,1.肝脏组织的提取,（1）组织取材： 取约100mg大鼠肝脏组织，用灭菌的剪刀将组织块尽量剪碎，放入1.5ml 灭菌的EP管中,1.肝脏组织

2、的提取,（2）超声匀浆： 加0.5mlRIPA裂解液（含50ulPMSF）,置于冰上，用超声匀浆器进行匀浆,超声每次10秒，重复3次,1.肝脏组织的提取,（3）冰上放置： 裂解完全后，冰上放置30分钟,1.肝脏组织的提取,（4）4度离心： 放入离心机中，4 12000rpm离心5min,1.肝脏组织的提取,（5）吸取上清： 取上清分装于0.2ml离心管中并置于20保存，待用,超声匀浆 要保持低温,超声强度 以不产生泡沫 为准,注意 事项,2.蛋白的浓度测定,考马斯亮蓝法 BCA法 紫外吸收法 Lowry法(Folin-酚试剂法) 双缩脲法,2.蛋白的浓度测定-考马斯亮蓝法,1976年由Brad

3、ford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。 考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250的最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。在595nm下，光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。,15,实验步骤,管号,试剂(ml),1. 取试管7支，编号，按下表加入试剂:,2. 混匀, 室温放置2 min。在波长 595nm 处以0号管调零，测定各管吸光度值。,16,以标准液的蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。,C（蛋白浓度）,A（吸光度）,Ax,cx,绘制标准曲线：,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,mg/mL,OD,实验内容

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