DNA提取实验方案

1、一、 脱腐1. 10ml离心管中加入0.5g沉积物（干重）和5ml脱腐缓冲液100mmol/L Tris-HCl,PH10.0,50mmol/L Na2EDTA,200mmol/L NaCl,100mmol/L Na4P2O7,1%(质量浓度)PVP,0.05%（质量浓度） TritonX-100，漩涡混合3min，60水浴5min，3000g离心3min。根据上清颜色与洗涤缓冲液颜色无明显差异。（土壤与沉积环境样品腐殖酸脱除新方略，席峰）2. 10ml离心管中加入0.5g沉积物（干重）和5ml PBS buffer(8g NaCl，02g KC1，144g Na2HPO4，024g KH2P

2、O4，溶于1L水中，pH=74) 旋涡混合3min, 60水浴5min, 3000g离心3min。根据上清颜色再重复洗涤与离心1-2次，至上清颜色与洗涤缓冲液颜色无明显差异。（从颗粒污泥中提取DNA的几种不同方法比较，陈竹）二、 裂解与提取1. 冻融+玻璃珠+溶菌酶+SDS法（可用于微生物群落分子生态学研究的活性污泥总DNA 提取方法研究，高平平）1) 置0.5g沉积物（干重）于10ml 的灭菌离心管中离心5m in( 8000g, 4) , 弃上清, 沉淀(约100mg) 悬浮于5ml无菌水中。向管内加入0.35g灭菌玻璃珠(直径23mm) , 将离心管管盖拧紧后置于旋涡混合器击打15min

3、, 离心8min (8000g, 4),弃上清,沉淀用于细胞裂解。2） 向沉淀中加入0.5ml灭菌的TENP缓冲液(50mmol/L Tris-base,20mmol/L EDTA , 100mmol/L NaCl, 0.01g/ml 聚乙烯吡咯烷酮, pH10) , 悬浮后将菌液在液氮中冷冻3min, 沸水煮2min, 重复3次后进行菌体离心(10min, 12000g, 4)。上清液快速置于冰上留用, 沉淀用于进一步裂解。3） 将沉淀悬浮在1.5ml的溶菌酶溶液中(0.15mol/L NaCl, 0.1mol/L Na2EDTA , 15mg/ml溶菌酶, pH 8) , 其中溶菌酶配制成

4、30mg/ml的母液, -20保存备用。37温浴1h后, 向菌液中加入1.5ml 10%SDS 溶液(0.1mol/L NaCl, 0.15mol/L Tris-HCl, 10% SDS, pH 8) , 上下摇匀,待菌液变清后离心10min (12000g, 4) , 取上清置于冰上留用。4） 收集两步的DNA上清液(33.5ml) ,用等体积的Tris-饱和酚抽提2次、酚+氯仿和氯仿各抽提1 次。用40ul的3mol/L乙酸铵和3ml无水乙醇沉淀DNA ,-20放置30min后离心(20m in, 14000g, 4)。用1ml的70%乙醇洗涤沉淀,离心10min (10000g, 4)。

5、DNA沉淀真空干燥后,溶于50ul 超纯水中, 加RnaseA 3ul (10mg/ml) , 37温浴1520min 消化RNA , 样品在-20保存备用。2. CTAB+溶菌酶+SDS法1） 称取0.5g干沉积物，置于灭菌的10mL离心管中2） 向离心管中加入1.35mL DNA裂解液（100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，1%CTAB，pH8.0，121高温灭菌），充分混匀，再加入溶菌酶50uL（100mg/ml），混匀，37温育30min；然后加入5uL蛋白酶K（20mg/mL），混匀后37温育30min。3） 向以上混合液中加入

6、300uL 10%SDS，混匀，与65温育10min。然后4000rpm，4离心10min。离心后移取上清液到灭菌的2ml离心管中。4） 向离心后的沉淀中加入450ul裂解液，100uL10%SDS, 混匀后65温育10min，4000rpm，4离心10min，取上清液到灭菌的2mL离心管中。此步骤重复两次5） 将三次取得的上清液混合，分装到灭菌的2mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），反复颠倒混匀三次，12000rpm离心5min。小心移出上清（蛋白层很细小）到灭菌的2mL离心管中。6） 重复上步骤，将最后所得上清液置于灭菌的1.5mL离心管中7） 向上清液中加入0.6倍体积异

7、丙醇，4放置至有丝状沉淀出现。12000rpm离心10min，小心弃去上清8） 向沉淀中加入1mL 4预冷70%乙醇洗涤沉淀。12000rpm离心2min，小心弃去上清。9） 将DNA沉淀置于无菌台中用无菌风吹干。向其中加入50uL无菌水（超纯水高温高压灭菌，以下步骤中无菌水均为灭菌超纯水），置于室温至其完全溶解。10）将DNA置于-20保存3. 玻璃珠+CTAB+SDS法（土壤微生物分子生态学研究中总DNA的提取，赵勇）1） 在预处理好的沉积物样品中加入0.35g灭菌玻璃珠(直径约1mm)和2mL DNA extraction buffer(100 mmol/L Tris，100 mmol/

8、L EDTA，200 mmol/L NaC1，2PVPP，3CTAB，pH 90)，高强度旋涡振荡10min2） 加入2mL SDS buffer(100 mmol/L Tris，200mmo1/L NaC1，3SDS，pH 90)，温和旋涡振荡10min3） 65水浴30 min(水浴过程中每隔10 min用手上下颠倒离心管3次) 8000rpm室温离心15min4） 收集中间的液相层剩余的残渣中再加1mL DNA extraction buffer和1 mL SDS bufier65水浴5min5） 8000rpm室温离心15 min，收集中间的液相层6） 合并液相层，按上述方法再把残渣抽

9、提1次，收集的液相层与上两次的液相层合并，12000rpm室温离心5min，收集上清液7） 等体积的氯仿异戊醇(24：1)抽提1次，15 000rpm室温离心20min，收集上清液8） 在上清液中加入01倍体积的3mol/L NaAC(pH 52)，用手颠倒混匀后，再加入06倍体积异丙醇室温沉淀DNA 1 h，15000rpm 室温离心20 min，弃上清液9） DNA沉淀用70乙醇洗涤1次，冷冻干燥后将DNA沉淀溶于500 mL灭菌ddH2O中三、 纯化1. 凝胶电泳法 1）配制0.8%琼脂糖凝胶 称取0.8g琼脂糖，加入到100mL 1TAE buffer中，摇匀，使用微波炉解冻档加热至融

10、化。将融化的琼脂糖倒入制胶模具中至完全冷却2）取5uL粗提DNA与1uL 6loading buffer混匀，点样3）130V恒压电泳2h4）电泳结束后，于EB染色液中染色20min，使用凝胶照相设备照相 检测如果粗提DNA条带较清晰，并无明显拖尾即可进行下一步的凝胶回收纯化步骤。 1）取100uL粗提DNA溶液混合10uL6loading buffer点样，130V恒压电泳2h。 2）将电泳后的凝胶置于EB染色液中染色20min，在紫外灯下观察条带位置，注意不要在紫外灯下照射过长时间。 3）用灭菌的手术刀将基因组DNA条带切割下来，切成碎片，置于已称重的2mL灭菌离心管中。 4）参照胶回收试

11、剂盒说明书进行凝胶回收过程。（最后一步用无菌水洗脱时先将无菌水加热至60后使用） 5）洗脱DNA时先加入无菌水洗脱一次，收集滤液，标记编号后于-20保存。然后再次用无菌水洗脱离心吸附柱，收集滤液，标记编号后于-20保存2. 葡聚糖凝胶G-200离心层析纯化1）取2ml灭菌过的一次性塑料注射器，用注射器推杆将灭菌过的玻璃棉推到注射器筒底部，使其厚度约为0.5cm2）向注射器筒中加入TE缓冲液浸透的葡聚糖凝胶G-200，制成简式离心层析住3）将注射器置于10ml离心管中，于离心机上以3000rpm离心20min4）去除葡聚糖凝胶G-200中的TE缓冲液5）将离心层析住置于另一10ml的离心管中在层

12、析柱顶部加入5ul粗提DNA，以10min为周期于3000rpm离心，分别收集层析液，层析液浓缩至5ul3. 葡聚糖凝胶G-200与凝胶电泳结合法先将DNA粗提物用葡聚糖凝胶纯化，再将层析液用方法1进行纯化。四、 PCR扩增1）取纯化后的基因组DNA1uL，用无菌水稀释至10-1倍后作为模板DNA使用2）PCR反应体系： 贮存浓度 加入体积10PCR buffer： 2.5uLPr： 50uM 0.2uLPf： 50uM 0.2uLTaq聚合酶:1U/uL 1UdNTP: 2mM 2.5uLH2O: 10uL模板： 10uL反应体系要在冰上配制先确定要配制的反应体系总量，然后向离心管中依次加入需要总量的无菌水、10PCR buffer、上下游引物、dNTP，最后加入Taq聚合酶。然后将上述混合物瞬时离心混匀，分装到各个PCR