Mega的使用以及进化树的绘制

1、1.MEGA构建系统进化树的步骤 2.CLUSTALX进行序列比对1.MEGA构建系统进化树的步骤1. 将要用于构建系统进化树的所有序列合并到同一个fasta格式文件，注意：所有序列的方向都要保持一致 ( 5-3)。如图：2. 打开MEGA软件，选择Alignment - Alignment Explorer/CLUSTAL，在对话框中选择Retrieve sequences from a file, 然后点OK，找到准备好的序列文件并打开，如图：。3. 在打开的窗口中选择”Alignment”-“Align by ClustalX” 进行对齐，对齐过程需要一段时间，对齐完成后，最好将序列两端

2、切齐，选择两端不齐的部分，单击右键，选择delete即可，如图：。4. 关闭当前窗口，关闭的时候会提示两次否保存，第一次无所谓，保存不保存都可以，第二次一定要保存，保存的文件格式是.meg。根据提示输入Title，然后会出现一个对话框询问是否是Protein-coding nucleotide sequence data, 根据情况选择Yes或No。最后出现一个对话框询问是否打开，选择Yes，如图：。5. 回到MEGA主窗口，在菜单栏中选择”Phylogeny”-“Bootstrap Test of Phylogeny” -“Neighbor-joining”，打开一个窗口，里面有很多参数可以

3、设置，如何设置这些参数请参考详细的MEGA说明书，不会设置就暂且使用默认值，不要修改，点击下面的Compute按钮，系统进化树就画出来了，如图：在菜单栏中选择”Phylogeny”-“Bootstrap Test of Phylogeny” “Minimun-evolution”,如图：在菜单栏中选择”Phylogeny”-“Bootstrap Test of Phylogeny” “Maximun-parsimony”,如图：在菜单栏中选择”Phylogeny”-“Bootstrap Test of Phylogeny” “UPGMA”，如图：6. 最后，使用TreeExplorer窗口中提

4、供的一些功能可以对生成的系统进化树进行调整和美化。CLUSTALX进行序列比对1. 将下载的序列放入一个Text文本文档中，序列按一定的格式，pigAGAGACGGCCGCATCTTCTTGTGCAGTGCCAGCCTCGTCCCGTAGACAAAATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGCCGTATTGGGCGCCTGGTCACCAGGGCTGCCATTTGCAGTGGCAAAGTGGAGATTGTTGCCATCAA的格式复制过来，放在一个文本文档里。注意：CLustal 1.83分析出了全序列比对，彩色比对区上门的*越多，表示这段序列越保守2. 在File-load seq

5、uence载入序列,如图所示3. Alignment进行全序列比对-4. 点击align5. 在桌面上即可生成aln格式的文本文档（用于下面Mega5.02进行进化树构建）Mega5.02序列比对及建进化树序列比对1. 用文本格式的序列数据进行比对2. Align-edit alignment即新建一个数据-0k-DNA3.Edit-insert sequence from file -选择文本文档4. Alignent-Align by ciust W-ok-关闭序列比对-并保存在桌面上-Phylogeny-MAX5. 两种不同的方法 最大释然和邻近法邻近法更准确建进化树1. File-co

6、nvert file format to mega 2.3. 点击文件夹从桌面载入aln格式的文本文档4.5. 点击OK，再命名6.7.8. 关闭窗口9. 点击OK10. phylogen-text neighbor -joining tree -或者Maximum的方式进行构建-从桌面上选择刚命名的文件11.点击打开12.13.14. 点击Yes15.16.17. 将Test phylogery中的None改成如图18.19.20. 进化树就构建成功-点击横线进行细节修改21.22. 点击左边第五个蓝色的图标进行细节修改23.可以双击分类后的名称，进行名称修改，如Primer 5设计引物1.

7、 File-New-DNA sequence2. 将序列复制过来（序列的格式必须是文本格式）-as is -OK3.点击Primer4. 点击S-File-perferences5.一般将长度设置为20，然后根据需要可以适当提到21或者降到19Length设置为20点击OK6. Search7. type-both-PCR size 100-1000-primer length 25-5-OK、点击OK8. 选择打分高的，且退火温度在55左右的温度。9. 可通过手动调节上面的序列，使得二者的打分最高，如退火温度较高，则可以把序列长度降低一点，如19，点击Edit Primer -可以把引物序列

8、复制下来引物的基本原则1. 引物的长度18-28，不能太长。引物越长特征性高，要求的退火温度越高，但是扩张效率较低，容易形成引物二聚体。2. G、C的含量在45-55%左右，但有时也可能比较高或者比较低，不是很重要，45-55%的范围只是最好的。G、C含量高，退火温度高。3.3端是最重要的，是起始阶段。最好是A、T、C、G随机均一分布，不能集中的分布；特别3端前段最好不要连续3个以上的G、C出现，不能很好的促发反应，只要3端的前10个碱基结合得好就行。5不是很重要，可以很多不配对。实际上3端连续出现G/C但是效果也比较好。GCCTCGTCCCGTAGACAAAATCCAGGGGGGCTAAGC

9、AGTT10.11. 外套和内套的设计 使得特异性更高要没有false priming 打分不一定都要100分退火温度在55度以上都行内套序列必须位于外套内设计外套228-818 sense CACGGCAAGTTCAACGGCACAnti -Sense TTTCTCCAGGCGGCAGGTCAG设计内套 310-585Sense CTGCCAACATCAAGTGGGGTGAnti -sense GTCCCTCCACGATGCCAAAG一般先用外套引物进行扩增，再用内套引物扩增。12. 设计交叉序列的引物（温度相差不超过5度）注意 ;这两个引物必须包括整个序列的90%以上的序列。31-944S

10、ensse CCGTAACTTCTGTGCTGTGCCAAnti sense AGAAGAGTGAGTGTCGCTGTTGAAGT226-1029Sense GCAAGTTCAACGGCACAGTCAAAnti -sense TGCTGTAGCCAAATTCATTGTCGTA13. 双重PCR设计 同时进行两个PCR扩增 两对引物之间碱基序列相差100左右31-247 63.5-63.5 100分Sense CCGTAACTTCTGTGCTGTGCCAAnti-sense TTGACTGTGCCGTTGAACTTGC311-628 87分 62.1-62.4Sense TGCCAACATCAAGTGGGGTGAnti -sense ACAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT14. 上游引物试剂盒已知的：如规定退火温度在73.2，则设计下游引物序列的温度在73左右，最好一样，不