PCR常见问题分析

1、PCR常见问题分析* _. u4 U4 j/ R5 O& g* O/ w3 n+ |PCR在产物序列中引入了错误？+ N7 w% ?4 b N参考见解：I: % B % c# E, C _% B1聚合酶忠实性低：使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。4 / p Q/ 4 d2 循环数太多：降低循环数。! f% O2 m% BQ/ W3 四种dNTP的浓度不同：制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。A1 H- l% # L, ?8 a- c5 U* n% |一步法和两步法有什么区别吗？% g, F3 A 3 u. _ 参考见解：其实一步法

2、并非是两步法的改进，根据实验目的不同，有时两步法会更好。举个例子，如果想对同一样本同时扩增2个以上的基因，那么一步法是从RNA开始的，即分别取相同量的RNA，然后逆转录，然后加入不同的primer PCR，方法固然简单，但逆转录酶很贵。如果两步法，可将RNA逆转录为cDNA，然后每次加入相同量的cDNA，再加不同的引物PCR，这样可比性强，而且不需逆转录，直接PCR即可。当然，如果想快速获得某一种基因，当然一步法好。所以一步法和两步法各有优点，不能一概而论。. c( - o4 S0 % i9 1 APCR跑胶，目的条带很亮，但是边沿不清楚，前后有拖尾现象，请教各位是什么原因？$ e& n7 V

3、+ P* S0 J1 Q3 - R参考见解：$ W6 f6 7 ih; d1模板可能有降解，建议避免反复冻融，放置时间不能太长。模板的质量是最重要的。+ cf, i1 5 X$ o2抽提RNA时有污染，包括基因组DNA污染和蛋白质污染，需重做抽提。; p7 M# K- O! j9 z) y6 _3提高退火温度，减少非特异性扩增。$ O1 r& # m: S, ) ?+ J) Q2 j4减少循环次数，减少非特异性扩增。9 . D! Q8 f0 _$ j5电泳缓冲液时间太长，ph值和盐离子浓度明显改变。. x& m2 U! N- P6电泳时电压不能太高，8V/cm。! + b* H1 T2 p6

4、m) X# I7一般来讲，基于promega和TaKaRa的PCR反应体系中，Mg和dNTP的浓度是相匹配的，不需改动。( n) d8 |) G) f/ j3 / K5 f2 8 加样量过大。过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。4 ) v+ ?2 Q: |4 e; g8 9制胶过程中胶孔没制好。( v6 I5 o, o, F! o& B10 EB没有冲洗干净。7 o4 c$ ; _& o5 / c9 Z) i* ! t11模板混有基因组DNA，或模板中混有蛋白。; J2 _2 1 P W12非特异反映。引物设计的不好，非特异，这种情况容易出现非特异扩增造

5、成有非特异性扩增带或拖尾现象。6 U9 s7 y9 u0 v/ m3 C4 x( U9 K13电泳液用久了不换，电泳胶脏了 。5 E. p5 M$ S* Z( R2 d$ _14扩增的条件不合适，一般退火温度低时容易使引物在非特异位置结合引发扩增反应造成拖尾。0 e0 P$ G7 W# K- F) t5 X+ S针对以上情况，可以先提高退火温度试试，如果实在不行，再看看引物是不是合适。& s0 t& r& J4 ?+ C- H如果内参可以扩出来，只能说明程序可能是适合的，但不能完全说明体系合适。体系内的各组分，如模板、dNTP、Mg离子、引物等都可能造成拖尾。先得考虑换了那种成分后出现了拖尾，

6、逐项试验。引物当然是最重要的因素，但绝非造成拖尾的唯一原因。而且，一般而言，拖尾不会是引物的问题，尤其是已经被用过证明能扩出特异片段的 引物，更不可能是它的问题了。先不要加Taq酶，等到其他东西都加完了以后，放到PCR仪上去，到那时再加，马上开启PCR程序试试。( W7 z6 d3 C9 s, I6 i检查一下你的dNTP的量够不够。适当减少23个循环试试，可能会有效果。- Jt. A% y5 S$ S% Z7 R1 u( k0 I9 PCR结果总是不满意，请问要注意些什么？: K8 V) u0 k- M# X0 B% g6 f8 q M参考见解：% H7 LQ4 b$ X& v2 |5 f1

7、将PCR反应的试管与反应板紧贴。 9 d8 O8 ?$ P c S$ ?4 O5 ?+ u( S8 X2当酶反应混合物以70“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。 ) s: E) A, 0 ! P! N3不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。 B8 h7 i) w5 K% b( C3 ?8 w4对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。 K( I$ J* j4 Z5没有扩增产物： 在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmo

8、l/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。1 |- G Ajl/ i6泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。 & P ( Z M) o7 PH7检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。 & * w/ Y2 y. ; n, y8检查模板和引物的用量。 ! E- e5 l$ n6 x# J4 i5 X9增加循环次数和/或模板DNA的用量。 / V3 I$ b- 5 b6 k5 B10泳道中出现模糊条带： 减少循环次数或模板DNA的用量。 提高

9、退火温度，但不要超过68。 重新设计引物或设计更长的引物。 M4 |+ U+ W1 n4 E7 Q11 建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92时不能有效地使模板变性。 最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。 大多数反应中，0.75ml（0.51ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。 建议使用1.75mmol/L MgCl2350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2500mmol/L dNTP组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。 * j( q; + C- O, x2 P% * 12基因组DNA模板

10、的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。 要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。 降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为2434个核苷酸，溶点在6068间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。 & I3 J# q! j2 B3 P7 i4 i13变性：第一步变性在94下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94

11、下进行20-30秒），除非模板中富含GC，则95下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。 # V5 |3 p/ u( p7 G# h$ e14延伸：68-72下进行延伸操作。 循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。 长片断PCR系统扩增的片断其3-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。 测序时因酶的混合物带有35外切酶活性

12、，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。 2 YH, v# w, W* 2 N15 引物设计： 一般长度20-30bp； 至少50%的GC含量； 避免引物二聚体和二级结构； 引物对的Tm值应该接近。 ! V; r) Y3 f6 t$ a经DEPC处理好的东西如EP管,剪刀等接下来该怎么办？是用双蒸水冲洗,还是用DEPC处理的水冲洗？1 K: k3 W) V/ q参考见解：+ J. - J5 W K& r1 V, I$ Y经DEPC处理好的EP管,应该去高压，既灭菌又去除了DEPC，DEPC再没高压的情况下是有毒性的。剪刀等浸泡后用DEPC处理的水冲洗。Ux; q) 4 d,

13、_/ W. d- s处理过程应该是这样的：在ddH2O中加入0.1的DEPC，用搅拌子搅拌2小时，使DEPC充分溶解在水里。然后将EP管,tip头及大离心管etc浸入以上水中，后放入37度培养箱中过夜，第二天倒掉液体后高压。（不是仅仅DEPC处理的水冲洗就可以的）。DEPC处理的水不重复使用。0 f! b4 t5 t0 q) 经DEPC处理好的东西如EP管,应先在70-80度烤干后，再高压剪刀 玻璃制品可以用DEPC处理后180-200度干烤2小时。$ p4 g+ B% DJ; c假阴性，不出现扩增条带？9 W! _: i, e4 r$ : N/ h! J参考见解：PCR反应的关键环节有模板核

14、酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。! g& . O. N9 j W$ x1 模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。8 w7 c- f: P2 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴

15、乙锭。! P1 M9 q0 t l) 3 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变

16、质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。4 Zq?# Q3 x5 J8 U4 z6 _4Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。8 D! k- e0 D8 G d) C; O8 G5 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。! d# c, N& Z1 f0 fl6 物理

17、原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。$ O2 g8 % y . B C T: A7 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。6 F+ U3 ?0 b3 - Q- u p. d% + q假阳性？出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更

18、整齐，亮度更高？/ X K) E9 W/ W7 ; u4 | D1 N参考见解：5 A0 Z/ K+ c3 A5 H1 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增 时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳 性。需重新设计引物。1 K( i8 * g4 R! r/ M2 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等

19、均应一次性使用。必要时，在加标本 前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩 增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。; W9 W- Ie( m出现非特异性扩增带？ PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带？! o3 Z7 w! U- s: K, p2 C( C参考见解：非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过

20、多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。/ y 6 v: X3 X6 O. oPCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带？% g! F: |9 I. T9 a( 参考见解：其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2

21、+浓 度。增加模板量，减少循环次数。4 O% Z - u y: ?+ o5 F克隆PCR产物的最优条件是什么？% X$ _ F0 f7 Y! Z% O参考见解：最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4oC过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4oC过夜。 c9 S* M) z: w/ O1 e 8 SPCR产物是否需要用凝胶纯化？&

22、R; i% g xj% W: y1 d) N3 u参考见解：如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。 7 . u8 c6 n# N# - b |/ P& ?4 如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？1 3 h a# s2 r3 h参考见解：$ b9 K5 N- z5 jz- O% t( F K1 涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。5 L4 x7 V2 z9

23、C7 A% * R5 b: G2转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态

24、细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。6 g! b$ _% e: |. ( U) I4 P5 D3 如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。6 E; P, I M1 T I4 用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如

25、产生20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。7 6 q- a9 b0 V3 b对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？2 b* + sB( e% Z& w, h8 D参考见解： _0 I0 X, r* I( 4 c# kF1 连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4oC过夜。7 / i+ i9 S D7 Y- z1 d/ Q2 插入片段带有污染，使3-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Ea

26、sy载体3-T缺失。- Q/ G) v/ G+ I3 插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。! B, J. d0 H( X, M# Z7 Q7 G4 带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。9 q/ h% q UX) Y) N& Q5高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用

27、重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞 N( P( u/ c/ a9 t) Q. - S将目的引物与内参引物同管扩增后，电泳结果不知为什么目的条带很弱，而内参条带很强。有没有办法调一下?) R* m# w5 H: l0 * I5 K/ q# T参考见解：造成这样的原因可能本身目的基因表达量少，所以扩增量少，条带弱，若不是目的基因表达量少，那就是实验PCR条件造成，需要优化条件。可以从一下几个方面尝试： 1 减少内参基因的引物浓度，适当增加目的基因的引物浓度。 2 改变退火温度，使其更适合目的基因。 3 换用新的目的基因引物，原引物扩增不一定合适。 4 若目的基因序列中GC含量较高，可以考虑换用增

28、强PCR反应的缓冲体系。 5 另外一点，若模板提取有问题也会影响结果。 % F2 / c: X2 % _ b k: l5 a+ G不慎加了10倍量的dNTP，对结果有什么影响？- I- o( W* Q* X7 b参考见解：dNTP可以与Mg2+结合, 从而降低体系中Mg2+浓度, 造成Taq的聚合活性下降.另一方面, dNTP过量, 可以增大错误扩增的几率, 导致出现非特异扩增产物和smear.7 S, A+ P% U: EPCR体系是10ul的，每次PCR完了以后，管壁上有一层水气，需不需要覆盖矿务油？加多少，具体步骤应怎样？. q3 y% z; % F( : V7 - |6 w参考见解：是

29、否覆盖矿物油，要看你用的是那种PCR仪了，目前新出的PCR仪都用不着加，因为有热盖技术、密封严格，如PE2700，2400，9600，9700等PCR仪，可以看看所用PCR仪的说明书，应该提到的。去除石蜡油比较有效的方法：1。PCR反应之后，把反应管放的-20C，冻上20-30分，石蜡是不会冻住的，等水相结冻之后，拿出管子，迅速把上面的石蜡油吸掉。2。用一张干净的Parafilm，将反应液点到上面，轻轻移动或提起膜，石蜡油比较粘膜而水相会流开，分开后吸取水相。! f/ U1 a; a* x1 Y1 cPCR假阴性原因？! + M; X- ; U+ ; U参考建议：) M3 P( m! z! Y

30、3 d0 I: R: s+ M1、 仪器因素：PCR实验对仪器的依赖性是很高的，离心机、扩增仪都是造成PCR假阴性的因素。扩增仪的主要问题是孔间差，引起扩增失败可扩增效率降低。而离心机的影响则更容易被忽视。国内使用离心机很少使用离心加速度（XXXg）作为参数指标，而常使用转数作为参数指标，这里就存在着一个问题，由于离心机的大小不同，有效跳心半径也不相同，因此同样的转速所产生的离心力相差很大(有的在数倍以上)，所以在相同的离心时间下，有可能模板并没有离心下来，造成PCR假阴性。这个问题在其他实验也有，但因基他实验都是测定大分子蛋白沉淀，对离心的速度要求较低所以不太明显。建议使用小型台式离心机的实

31、验要注意一下这个问题。( 3 e E% z+ H3 Y4 Y$ B2、 试剂质量问题：PCR实验的成功与否试剂的质量至关重要，试剂的质量问题涉及多个方面：细胞的裂解；模板的抽提；引物位点的选择；Taq酶的活性等等。其中任一环节出了问题都会引起结果的假阴性。这些都是试剂质量的问题，因此选用高质量的PCR试剂非常重要。( ll, l2 a8 i+ U- O. Q9 F8 C3、核酸模板问题：核酸模板质量问题是制约PCR最重要的因素之一。核酸模板在扩增区出现断裂、蛋白粘附、空间位阻等模板质量问题都有可能引起扩增失败造成结果的假阴性或定量不准确。由于无论什么提取方法都不可能得到完全理想化的核酸模板，因

32、此核酸模板质量虽然与试剂的质量有关，但它不可能由试剂质量完全解决。核酸模板问题除了模板本身的问题外，还存在模板溶液中抑制Taq酶活性成分（如某些蛋白、离子等）作用，而导致扩增效率降低甚至扩增失败的问题。对此，有人提倡进行模板纯化，效果较为明显。但另一个问题又出现了，那就是怎样保证纯化的回收率问题。总之，核酸模板问题是不可避免的问题，只能努力去减少。8 Q( L4 v) |! H9 f4、 操作人员问题： PCR实验的环节很多，而且对每一环节的质量要求都很高，例如少加、漏加试剂、离心不充分、循环参数设计错误、对于RNA抽提降解、逆转录失败等等都能造成结果的假阴性。因此要求PCR的实验操作人员有很

33、好的素质，能够严格遵守操作规程，并能敏锐的发现问题和解决问题。E s* o0 P0 V+ . y: I5、 其他：PCR实验中从样品的采集、运输、保存开始就可以引起结果的假阴性，而对于病原体检测（如HBV）在人体血液系统出现有周期性变化也是值得注意的因素。8 h/ K4 O# R5 V/ N2 iPCR加样孔上有很亮的条带，但没有产物条带？; e8 U|9 4 x& 2 q) x! i/ |参考见解：最大的可能性是蛋白质（taq酶）与产物结合，滞留在加样孔。解决方案，loding buffer加入0.1sds为了排除其它可能（例如大片段），可以作一个无反应对照，所有条件都一样，就是不上PCR仪

34、器。然后同时跑电泳，看看上样孔内情况。$ 8 T; k H3 q2 S; GPCR的产量有许多因素决定他们的主次关系是什么,各因素又是怎么调节的？( i s) c e& H7 XN& t参考见解：, q. ?0 B& X# E4 t7 Y1、 退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。 I+ r1 |2 ) 2 L d7 V2、 减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。* s! 3 a/ s3 p& U/ K3、 引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。2 o7 q! i/ e5 Y% 4、 改变MgCl2(有时

35、KCl)浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对Taq酶的直接作用。* F5 F G( i% I n9 l, X! n5、 模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹结构时，可在PCR混合物中的4dNTPs中加入7-脱氮-2-脱氧鸟苷-5-三磷酸（7-deaza-2-deoxyguanosine-5-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP与dGTP比例为3：1的混合物（150mol/l de7GTP +50mol/L dGTP）代替200mol/l dGTP，则可阻非特异性产物的生成。& V; e% X4 v8 h5 v9 e造成PCR进入平坡的原因是什么

36、？5 g& W# z6 X% D4 E- y* k参考见解：引物和dNTP等消耗完毕、Taq酶失活，这几中因素在标准反应中均不会出现。此外，还有几种可能：ab7 t8 s2 M! E1、 底物过剩因DNA合成量多于反应液中存在的Taq酶，在100l反应液中含2.5Utaq酶而DNA合成量达1g（3nmol脱氧核苷酸）时，开始变为底物过剩。延长延伸时间或添加Taq酶，可以克服之。但不实用，因每进行下一循环就要延长延伸时间一倍及多加一倍Taq酶，才能继续保持指数增长。* 7 , R* d: U3 6 K7 ? j2、 非特异性扩增产物的竞争与上述情况密切相关，此时不需要的DNA片段与需要的片段同时

37、竞争聚合酶，要克服这一情况是要提高反应特异性，使不需要片段不能大量积聚。9 j4 ! h9 y$ . M8 J- o3、 退火时产物的单链自己缔合两条单链的DNA片段在退火时除了与引物缔合外，也可以自行缔合，这也会阻止产品增多。当产物浓度到达10pmol/100l时即可发生此现象，除稀释外无法克服。. |, V4 m) V9 J3 f& ?4、 变性在高浓度产物条件下，产物解链不完全，以及最终产物的阻化作用（焦磷酸化，双链DNA）。. Y# ao& o5 l2 R总而言之，PCR的条件是随系统的而异的，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后稍稍改变各参数，可以达到优化，以取得优良的特异

38、性和产率。# D! f8 T0 N( q- EPCR产物大约有900bP，哪种测序方法比较好？直接用纯化的PCR产物测序还是克隆到T载体上再测序？纯化PCR产物的方法哪种比较好？ B2 Wd8 g( h2 j7 f8 - 4 p参考见解：5 O! W+ b% s, n % v) m1、 PCR产物直接测序对PCR产物纯度要求较高。体系中不得有杂带，引物二聚体等。另外PCR产物在体系中需达到一定量，一些低丰度的模板，则需通过增加循环数来达到，但循环数太多易出现突变。克隆到T载体上比较好。经典，且利于保存。酶切鉴定后，选取有正确插入片段的克隆，在将此克隆菌种摇过夜，用1.5毫升EP管装菌液，送公司

39、测序。这样的好处是：公司可以自行铺板子保存菌种，如果第一次测序失败，还可以挑菌落继续测。) I; E5 A4 d7 b4 ?3 2、 测序的一个反应大约可以测500bp，在T载体多克隆位点两侧有T7和SP6两种测序引物，如果片段小于500bp，只测一端就够了。如果大于500bp，建议采用双向测序，同时测T7和SP6两个反应，然后将测序结果拼接起来。这项可以让公司完成，也可以自己用软件完成（如DNASTAR）。7 . f a$ r* m9 d3、 关于纯化PCR产物，建议采用经典的切胶方法。这种方法回收率为50左右。用此法一般都要用酚氯仿抽提，这是从溶液中去除有机胶必需的。这也是造成产物损失的主

40、要步骤。7 C/ G, T9 D, 7 u R引物间形成了比较多的二聚体，使产物很少。这种情况该怎么处理？& V1 w3 f( U$ e7 t/ E0 x参考见解：9 tj: F# m8 K+ R: a L1、 不能重新设计就试试降低一下引物浓度，调整一下体系如优化镁离子浓度或改变模板量。形成引物二聚物的原因很多，如聚合酶是否活化,还有program，退火温度太高，时间太短，延伸时间太短都可能是原因。4 Dk$ X3 O# c2、 适当提高退火温度并调整体系中的Mg2+浓度，结合热启动，通常可以有效减少引物二聚体的量。当然，同时也可以减少引物的量，也会有一定的帮助。9 3 m/ U0 S! o

41、7 a3、 还可以做套式PCR:即在目的片段两端外面选择序列设计一对引物,这对引物因为没有位置的限制,可以设计的理想一点,扩增出比目的片段稍长的一段后,作为模板用楼主现在的引物来扩增,比直接扩更有效。$ F s6 O9 I( b) G6 C什么是热启动？/ G) Ky9 e8 N& G5 D4 o参考见解：所谓的热启动，是将样品放于PCR仪中反应，待样品在94度充分变性后，再加入酶于样品中进行PCR。缺点是操作不如冷启动方便。无论什么时候，加样或者其他的操作，均相的反应效率最高。W2 L& G1 jC: q) OSS与SS有区别是什么？为什么有人更喜欢用SS而不是ThermoScript？9

42、M; v. O+ h# & o, f参考见解：2 L& F3 a1 - & G1、 具有更高的热稳定性（达50）2 t# c5 K3 |# D, O3 u2、 具有更长的半衰期（达220分钟）$ A+ Y t8 0 W4 E7 . g5 3、 对PCR无抑制! v& V7 G$ w; z4 u4、 干冰运输# K. w: ?% j1 Bp- X& m( L5 s% w5、 Tdt活性更低. c p7 p& A3 x) u6、 SuperScript反转录酶。, Y, q1 l, V3 L1 h# F5 o8 _b9 W3 Q5 fThermoScript如果保存不当会引起活性很快降低，SS则更

43、稳定。5 U* ; y# _0 J7 G5 b# j什么情况下需要使用RNase H？ 2 + c. g: T# P% p5 V# N6 Ob参考见解：在第一轮PCR中RNA/DNA杂合体不能正常变性时。. I& P5 / B! K: q5 P为什么会产生弥散（smear）条带？如何解决？0 6 H1 z/ wA* W参考见解： 在PCR反应体系中第一链产物的含量过高。5 v H0 f6 Q: t; d1 W! N c, s1、 减少引物的用量。/ D2 e- W1 y% n, l2、 优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数。4 V) |/ |7 F* J3、 在用DNase处理被DNA污染

44、的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。. p* J1 e 6 _% : x镁离子浓度过高会有什么情况？ u0 w , 1 S6 z: b, E, m y参考见解：镁离子浓度1.5mM是优化的条件，但不是最佳的条件，实验者可以根据自己的实验要求来调整镁离子的浓度。但是浓度过高会出现非特异性的条带。& f9 b( G! X& c2 |4 H出现多种扩增产物条带？怎么解决？S! / s3 C1 OZ参考见解：3 c, h$ b6 I5 B1、 应用降落PCR，最好再结合热启动PCR或加强PCR（booster PCR）。* v& X( # G m. e. H3

45、 W( b2、 优化MgCl2、模板DNA、热稳定DNA聚合酶及dNTP的浓度。8 6 U- F+ S1 V7 o3、 用首次扩增的PCR产物进行1：100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第二次PCR扩增；9 C7 g0 g! U# i5 m3 M* h; E# 4、 进行嵌套式PCR扩增；或者从凝胶上切割目的条带作模板重新进行PCR扩增。3 l( n7 U: 6 n克隆PCR产物的最优条件是什么？: Z. r7 b/ D9 B4 D4 p+ l |参考见解：最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：

46、1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4过夜。2 W3 ; d3 ) _6 K r: R4 & 5 LPCR产物是否需要用凝胶纯化？7 g8 m& u% Z1 M- L/ V6 j& c+ - c参考见解：如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片

47、段。为此需在克隆前做凝胶纯化。# C7 I5 A) O1 Q如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？/ N4 3 c7 a/ 4 t- 5 a参考见解：) b2 * K& t% p( i& N$ e0 F( d1. 涂布未转化的感受态细胞。. u/ F1 U0 J- a9 b7 w: T2. 如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。! r3 e7 Y) 5 f9 M- e& f# S$ ZB）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺

48、板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为： 1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug 转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。6 K. 1 H: w4 d7 _3. 如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态

49、细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。, K e; R r5 h; l5 d! S4. 用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。, _0 Y: i x3 ?4 0 x对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？1 % B0 4 w+ q: t7 p9 j参考见解：2 e( E8 _: p 3 A) r8 Q1. 连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提