第五章 双水相萃取技术.ppt

1、第五章 双水相萃取技术 (Aqueous Two Phase Extraction),双水相萃取(aqueous two-phase partitioning) 是1896 年Beijerinck 把琼脂和可溶性淀粉或明胶相混合时最早发现的。1956年，瑞典伦德大学的Albertsson重新发现此体系并第一次用来提取生物物质。1979年，Kula和Kroner等人将双水相体系用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，使胞内酶的提取过程大为改善。此后，对于双水相体系的研究和应用逐步展开并取得很大进展。在提纯有生理活性的生物物质方面，与其他提取方法相比，它具有许多优势。现在双水相萃取已被广泛用于蛋白质、酶

2、、核酸、病毒、细胞、细胞器等生物产品的分离和纯化，并逐步向工业化生产迈进，展现了在食品工业、生物学研究和生物工程方面的巨大应用前景。,双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相容性，当聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不互溶的两相。 因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两相中水分都占很大比例(8595)，活性蛋白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同比例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的缺点。,现代生物技术中，基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺

3、寸的变化给固-液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。因此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。其中双水相萃取技术(又称水溶液两相分配技术)是近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。,一、双水相萃取的基本特性,2 种天然的或合成的亲水性聚合物的水溶液相互混合时，最常见的现象是，由于2 种聚合物间存在较强的斥力或空间阻碍，使2者无法相互渗透，不

4、能形成均一相，故达到平衡后形成两相，这2 种聚合物分别位于互不相溶的两相中，即形成聚合物/聚合物双水相体系。另外，某些聚合物溶液和一些无机盐溶液相混时，在一定浓度下，由于盐析作用，也会形成两相，即聚合物/ 无机盐双水相体系，常用的无机盐有磷酸盐和硫酸盐。除高聚物、无机盐外，能形成双水相体系的物质还有高分子电解质、低分子量化合物。,可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)/葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。双水相萃取中常采

5、用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，下相富含无机盐。,各种类型的双水相体系,常用的双水相体系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(dextran) 体系和PEG/磷酸盐体系。PEG/dextran体系一般用于小规模地分离生物大分子、膜、细胞等，PEG/无机盐体系主要用来大规模地提纯酶，这是因为PEG/无机盐体系的萃取专一性更高，葡聚糖价格昂贵的缘故。 物质在两相中的选择性分配是疏水键

6、、氢键和离子键等相互作用的结果，可溶性物质的分配情况可由分配系数K来表征，细胞这些更大颗粒的分配情况则由分配比P来表征。影响蛋白质及细胞碎片在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH值、温度等。,双水相萃取的基本特点,(1) 体系有生物亲和性。两相中的水分含量通常高达65%90% ，所用的PEG、dextran等高聚物或磷酸盐、硫酸盐等无机盐对蛋白质、核酸等生物活性物质无毒害，甚至还有稳定保护作用，而且相界面张力比水-有机或有机-有机两相体系的界面张力要小13 个数量级。由于生物活性物质在有机溶剂中易变性，再加上有的生物活性物质亲

7、水性很强，不溶于有机溶剂，有机溶剂萃取等分离技术难以在生物活性物质的分离中发挥其效能。,(2) 与常用的亲和层析相比，双水相萃取能够在较少的溶液量和较短的操作时间内获得较高产量的产品。另外，操作能够容易、精确地按比例放大，非常适合大规模应用，可进行连续生产。而亲和层析由于操作难于放大，应用受到限制。 (3) 聚合物的浓度和分子质量、无机盐的种类和浓度、pH 以及温度等均能影响被分配物质在两相间的分配，所以操作容易进行控制，进而达到目的产物的最佳萃取条件。 (4) 可与细胞破碎相结合，即细胞悬浮液中加入PEG和无机盐后再通入珠磨机进行破碎，然后用离心机分相。既节省了萃取设备和时间，又避免了胞内酶

8、的损失。,(5) 能进行萃取性的生物转化。在一些双水相体系中可将发酵生产过程中的生物转化与下游处理的第1步相结合，即生物反应在其中一相中进行，同时生成的反应产物被连续萃取到另一相中。不仅解决了产物反馈抑制作用造成的产量低的问题，而且酶在高聚物溶液中比在缓冲液中更稳定，活性更大。因为生物反应和生物产物的提取同时进行，尤其适于连续生产。,(6) 亲和萃取(亲和分配) 可大大提高分配系数和萃取专一性。由于目标蛋白质与其他杂蛋白的理化性质相近，造成其萃取专一性不高。亲和萃取就是将一种和目标蛋白质有很强亲和力的配基与一种成相聚合物共价结合，该成相聚合物与另一种成相聚合物形成双水相体系进行萃取时，目标蛋白

9、质专一性地进入结合有配基的那种成相聚合物所在相中，其它杂蛋白则进入另一相。此技术已用于乙醇脱氢酶、丙酮酸激酶和核酸内切酶等酶以及细胞、细胞器、膜等粒子的提取。,双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质25倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还是成本上都要优越得多。比传统的分离方法(如盐析或有机溶剂沉淀等)相有很大的优势，因此已被广泛地应用在生物化学、细胞生物学和生物化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病毒等产品的分离纯化和分析等。用此法提纯的酶已达数十种，其分离过程也达到相当规模，如乙醇脱氢酶的分离已达到几十千克

10、湿细胞规模，-半乳糖苷酶的提取也到了中试规模等。,双水相萃取的优点,操作条件温和，在常温常压下进行。 两相的界面张力小，一般在10-4N/cm量级，两相易分散。 两相的相比随操作条件而变化。 上下两相密度差小，一般在10g/L。因此两相分离较困难，目前这方面研究较多。 易于连续操作，处理量大，适合工业应用。,二、双水相萃取的原理,依据悬浮粒子与其周围物质具有的复杂的相互作用： 氢键 电荷力 疏水作用 范德华力 构象效应,聚合物的不相溶性(incompatibility)：当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚

11、合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。图a和b分别为PEG/Dx和PEG/KPi系统的典型相图,1 双水相系统,a,双节线,系线,b,双节线,均相区,均相区,两相区,两相区,系线,临界点,在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即,系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时，即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1，因此K点称为临界点(cri

12、tical point)。,2 双水相中的分配平衡,与溶剂萃取相同，溶质在双水相中的分配系数也用m=c2/c1表示。为简便起见，用c1 和c2分别表示平衡状态下下相和上相中溶质的总浓度。,生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用等。因此，分配系数是各种相互作用的和:,lnm=lnme+lnmh+lnml,me，mh，ml 分别为静电作用、疏水作用和生物亲和作用对溶质分配系数的贡献。,实际的双水相系统中通常含有缓冲液和无机盐等电解质，当这些离子在两相中分配浓度不同时(即分配系数1)，将在两相间产生电位差，此时，荷电溶质的分配平衡将受相间

13、电位的影响，从相平衡热力学理论推导溶质的分配系数表达式为:,lnm=lnmo+FZ/RT,因此，荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比,由于同一双水相系统中添加不同的盐产生的相间电位不同，故分配系数与静电荷数的关系因无机盐而异.,2）疏水作用,一般蛋白质表面均存在疏水区，疏水区占总表面积的比例越大，疏水性越强。所以，不同蛋白质具有不同的相对疏水性。在pH为等电点的双水相中，蛋白质主要根据表面疏水性的差异产生各自的分配平衡。同时，疏水性一定的蛋白质的分配系数受双水相系统疏水性的影响。因此，有必要确定双水相系统的疏水性尺度，以便在萃取操作时调整和设计蛋白质的分配系数。PEG/Dx和PEG/

14、无机盐等双水相系统的上相(PEG相)疏水性较大，相间的疏水性差用疏水性因子HF (hydrophoblc factor)表示。HF可通过测定疏水性已知的氨基酸在其等电点处的分配系数maa测算,lnmaa=HF(RH+B),其中，RH为氨基酸的相对疏水性(relative hydrophobicity)，是通过测定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差别确定的，并设疏水性最小的甘氨酸的RH0。,B = lnmGly/HF,所以，pHpI时氨基酸在双水相系统中的分配系数与其RH值呈线性关系，直线的斜率就是该双水相系统的HF值。,利用前式可确定不同双水相系统的HF值。如果在pH为等电点的双水相中蛋白质的分配系

15、数(m0)与HF值之间呈线性关系，则直线的斜率定义为该蛋白质的表面疏水性，用HFS (hydrophobic factor of solutes)表示,lnm0=HF HFS,一般形式,lnm=HF(HFS+HFS)+ FZ/RT,该式较全面地描述了双水相系统的疏水性和相间电位、蛋白质的疏水性和净电荷数对分配系数的影响，同时也间接地通过盐对蛋白质表面疏水性和相间电位的影响表现了盐对蛋白质分配系数的作用。,3 双水相系统中目标物分配系数的影响因素,成相高聚物浓度界面张力 成相高聚物的相对分子量 一般来说，蛋白等高分子量物质易集中于低分子量相 电化学分配 双水相萃取时，蛋白质的分配系数受离子强度的

16、影响很小 疏水反应 生物亲和分配 温度及其它因素,双水相系统的聚合物组成(包括聚合物类型、平均分子量)，盐类(包括离子的类型和浓度、离子强度、pH值)，溶质的物理化学性质(包括分子量、等电点)以及体系的温度等。 这些参数并不是独立地起作用。所以要预测溶质在双水相系统间的分配系数是困难的。这些系统复杂性表现在如下的一些例子中：在一相中引入疏水性基团会影响离子的分配和电位，在大分子(亲水聚合物或蛋白质溶质)结构中构象的变化，能使另一些原子暴露在微环境中。这些事实导致只能用实验的方法来确定满足分配要求的操作条件。,1）双水相中聚合物组成的影响,双水相系统作为一种成功的萃取方法，很大程度上取决于使用的

17、聚合物类型，当两种不同聚合物的溶液混合时，可能存在三种情况：a 完全混溶性(匀相溶液)；b 物理的不相溶性(相分离)；c 复杂的凝聚(相分离,聚合物聚集在同一相中，纯溶剂-水,聚集在另一相中)。离子和非离子聚合物都可以使用在双水相系统的构成上，但是，当这两种聚合物是离子化合物并带有相反电荷时，它们互相吸引并发生复杂的凝聚。,2）双水相系统物理化学性质的影响,双水相系统的性质主要取决于下列物理化学参数：密度()和两相间的密度差，黏度()和两相间的黏度差以及表面张力()。,系线长度代表了系统达到平衡时上、下相和总组成的关系，在临界点附近系线的长度趋向于零，上相和下相的组成相同，因此,分配系数应该是

18、1。随着聚合物和成相盐浓度增大，,系线的长度增加,上相和下相相对组成的差别就增大，产物如酶在两相中的界面张力差别也增大，这将会极大地影响分配系数，使酶富集于上相。,3）盐和缓冲液的影响,盐的种类和浓度对分配系数的影响主要反映在对相间电位和蛋白质疏水性的影响。在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数，不同电解质的正负离子的分配系数不同，当双水相系统中含有这些电解质时，由于两相均应各自保持电中性，从而产生不同的相间电位，因此，盐的种类(离子组成)影响蛋白质、核酸等生物大分子的分配系数，盐浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相体积比。例如，PEG/KPi

19、系统中上、下相(或称轻重相)的PEG和磷酸钾浓度以及Cl离子在上、下相中的分配平衡随添加NaCl浓度的增大而改变。这种相组成即相性质的改变直接影响蛋白质的分配系数。离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这一特点，通过调节双水相系统中的盐浓度，可有效地萃取分离不同的蛋白质。,温度影响双水相系统的相图，因而影响蛋白质的分配系数。但一般来说，当双水相系统离双节线足够远时，温度的影响很小，1-2度的温度改变不影响目标产物的萃取分离。 大规模双水相萃取操作一般在室温下进行，不需冷却。这是基于以下原因：(1)成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋白质一般不会发生失活或变性；(2)常温下溶液粘度较低

20、，容易相分离；(3)常温操作节省冷却费用。,4）温度的影响,温度对双水相系统的影响,三、双水相萃取的工艺流程,双水相体系在工业上主要用于从发酵液、细胞培养液中分离细胞碎片，提取酶或蛋白质。图是用PEG/无机盐体系通过2步萃取从产氨短杆菌中回收延胡索酸酶的流程，主要由3部分组成：(1 目的产物的萃取；(2) PEG的循环；(3)无机盐的循环。,图1 连续错流萃取回收酶的流程图,1）目的产物的萃取,细胞悬浮液经珠磨机破碎细胞后，与PEG和无机盐在萃取器中混合，然后进入离心机分相。通过选择合适的双水相组成，一般使目标蛋白质分配到上相( PEG相) ，而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相(富盐相

21、) 。主要原因有： (1) 核酸和多糖由于其亲水性，易分配到富盐相，目标蛋白质只有分配到富PEG相才能达到分离目的。 (2) 下相的高盐浓度易造成蛋白质失活或沉淀，而PEG对蛋白质有保护作用。 (3) 细胞碎片分配在下相有利于连续式离心机分离，如在上相易堵塞离心机出口。,第1步萃取后的上相中还含有较多杂蛋白及一些核酸、多糖和色素(色素因其疏水性分配在上相) 等，可通过加入适量的盐，再次形成PEG/无机盐体系来进行纯化。目标蛋白质仍留在PEG相中。,图2 用双水相萃取法提纯酶的流程图,在第3步萃取中则将蛋白质转入富盐相，从而将蛋白质与PEG分离开(图2)。但从经济角度考虑，一般用2步萃取，即在第

22、2步将目标蛋白质转入富盐相。 2 ）PEG的循环 在大规模双水相萃取过程中，成相材料的回收和循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可以节约化学试剂，降低成本。PEG回收有2种方法：一种即前面所述的加入盐使蛋白质转入富盐相来回收PEG(图2) ，一种是将PEG 通过离子交换树脂，洗脱剂先洗出PEG，再洗出蛋白质。现在常用的方法是将第1步萃取的PEG 相或除去部分蛋白质的PEG相循环利用(图1) 。,3 ）无机盐的循环 一种方法是将含磷酸钠的盐相冷却到6 ，使盐结晶析出，然后用离心机分离收集；另一种是用电渗析法、膜分离法回收盐类或除去PEG 相的盐。双水相萃取所用的设备一般都是其他两相体系如水-

23、有机溶剂体系所通用的设备，商业化的混合器-沉淀器系统以及离心分离机已成功应用于双水相萃取。用磁性分离等新技术也可提高两相分离。尽管刚开始应用时，大多数双水相萃取是间歇式的，但此技术更适合于错流萃取的连续生产，这样可有效利用空间和时间，尤其是在与其他分离技术如凝胶过滤、膜分离等相结合使用时。1988 年，Hustedt 等人证明在工业生产规模上可将双水相体系用于连续错流萃取延胡索酸酶和青霉素配基转移酶。,双水相萃取技术与层析技术间的相互关系,工业上一般先用超滤等方法浓缩发酵液，再用双水相萃取酶和蛋白质，这样能提高对生物活性物质的萃取效率。最后，用层析等技术进一步提纯以得到产品。所以，双水相萃取技

24、术是对层析等高度专一性提纯方法的补充，而不是代替。,四、双水相萃取技术在生物、食品工业中的应用,双水相萃取在生物和食品工业等领域的研究和应用发展较快。到目前为止，双水相萃取应用及研究主要集中在以下几个方面： (1) 提取酶和蛋白质。这是双水相体系研究和应用最多的方面，发酵液、细胞培养液、植物、动物组织中细胞内、外的酶和蛋白质均可用双水相体系来提取。工业上已有几种双水相体系用于从发酵液中分离提取蛋白质和酶，绝大多数是用PEG作上相成相聚合物，葡聚糖、盐溶液和羟甲基淀粉的其中一种作下相成相物质。,Lin等用双水相亲和萃取技术从兔肌中提取乳酸脱氢酶(LDH) ，实现了实验室规模的提取，纯化因子达7，

25、收率80%以上，萃取过程稳定可靠，并且聚合物和染料得以充分地循环使用。Johnsson等曾利用接有染料配基的PEG/葡聚糖双水相系统从猪肉中提取LDH。经提取和纯化得到的LDH，比活可达456494U/mg，他们还对这一技术的放大进行了摸索和探讨。,(2) 进行萃取性生物转化。应用实例有：利用葡萄糖和淀粉生产乙醇、利用葡萄糖生产丙酮丁醇、利用淀粉和纤维素水解生产葡萄糖、水解酪蛋白、发酵生产乳酸、将青霉素G转化为6-氨基青霉烷酸等。 (3) 食品工业中用来从酸水解产物中提取二肽、氨基酸、核苷酸等风味物质。在生物技术方面，可用来提取DNA。 (4) 萃取细胞、细胞器、膜等粒子。大多数都是用亲和萃取

26、方法来达到目的的。 (5) 应用于液- 液分配层析(LLPC)。将一种聚合物连接在固体颗粒(支持物) 上，另一种聚合物的溶液作为流动相，这种柱层析技术可分离蛋白质、核酸以及细胞混合物。,(6)中草药中有效成分的提取：近年来有关双水相提取天然药物中有效成分的报道逐年增多。以乙醇-磷酸氮二钾-水双水相体系萃取甘草有效成分，在最佳条件下，分配系数 (K)达12.8， 收率(Y)高达98.3%。用双水相萃取体系富集分离银杏叶浸取液的研究，也有良好的分配系数和分离效果。 (7)双水相在金属离子分离中的应用：传统的金属离子溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境、对人体有害、运行成本高、工艺复杂等缺点。近年来，利用

27、双水相技术萃取分离金属离子达到了较高的水平。,新型双水相系统的开发： 在生物物质分离过程中得到应用的双水相系统有2类：非离子型聚合物/非离子型聚合物/水系统和非离子型聚合物/无机盐/水系统。因为这2类系统所用的聚合物无毒性, 己被许多国家的药典所收录, 而且其多元醇、多元糖结构能使生物大分子稳定。但在实际应用中, 这2类双水相系统各有优缺点, 前者体系对生物活性物质变性作用低, 界面吸附少, 但是所用的聚合物如葡聚糖价格较高, 而且体系黏度大, 影响工业规模应用的进展；后者成本相对低, 黏度小, 但是由于高浓度的盐废水不能直接排入生物氧化池, 使其可行性受到环保限制, 且有些盐对敏感的生物物质会在这类体