关于循环肿瘤细胞(CTC)的一些认识

1、对循环肿瘤细胞球(ctc )的认识摘要：通常将进入人体外周血的肿瘤细胞球称为循环肿瘤细胞球(circulating tumor cell )。 随着循环肿瘤细胞球研究的深入，特别是随着现代检测技术的广泛应用，ctc逐渐受到重视。 循环肿瘤细胞球的检测可有效用于体外早期诊断、化疗药物物快速评价、临川筛药、药物耐受力检测、肿瘤复发监测、肿瘤新药物的研制等。 ctc的检查有很好的应用前景，随着这个研究领域的发展，会产生新的诊疗手段，将肿瘤的治疗提高到新的阶段。牛鼻子字：循环肿瘤细胞球ctc； 检测方法临床意义1896年，ashworth报道在死于癌症患者的外周血中发现了与肿瘤相似的细胞球，首次提出循

2、环肿瘤细胞球(circulating tumor cell，ctc )的概念1。 随着循环肿瘤细胞球研究的深入，特别是随着现代检测技术的广泛应用，ctc逐渐受到重视。一、概要ctc是指自发性或诊断操作进入外周血循环的肿瘤细胞球。 随着肿瘤细胞球的增殖，一些细胞球可以分泌细胞抑制黏附因子表达的物质，提高其运动能力，使之脱离肿瘤母体。 这些个脱落的肿瘤细胞球能分泌细胞蛋白质溶解酶催化剂，破坏周边宿主的结缔组织，进入脉管系统。 诊疗操作还可以使肿瘤细胞球扩散到外周血循环。2 .检测方法2.1免疫细胞球化学(immunocytochemistry，icc )该检测方法基于抗原抗体结合反应的原理，将单克

3、隆抗体(mcab )与特异的肿瘤标志物结合，通过酶催化剂和底物反应的显色来判断肿瘤细胞球的存在。 检测出的肿瘤标志物主要分为3种：上皮细胞球角蛋白(ck )，如ck19； 上皮胞质膜特异性抗原，如粘蛋白类、ema、hmfg、hea125等； 肿瘤相关糖蛋白(tag )，如tag12。 1980年，sloane等人首次用icc的方法检测乳腺癌患者骨髓中的肿瘤细胞球。 此方法形态学分析，但检出的细胞球量少，易感性只有10-410-5 (即在1万10万个单核细胞发现了肿瘤细胞球)，而且多数分化差的肿瘤不能表达目标抗原，上皮细胞球细胞球角蛋白和上皮细胞球抗原可能也是阳性braun等人2认为ctc不表达

4、白细胞共同抗原cd45，因此通过采用cd45-/ck双标准技术能够提高icc检查的专一性。2.2聚合酶链式反应(原则链反应，pcr )该方法的原理是特异性扩增肿瘤细胞球中癌基因、抑癌基因的突然变异或染色体重排而产生的dna异常。 此类基因的变化应满足以下条件：该基因的突然变异在待检查肿瘤中发生率高，至少应达到50%左右；基因内发生盐化学基突然变异的部位应相对集中，分散过度，目前临床应用困难。 该方法检测肿瘤细胞球易感性约110-6左右，比southern印迹杂交法提高约10万倍。 应用pcr技术检测ctc对肿瘤专一性和高表达标志物受到缺乏的限制，这种方法不仅灵敏度高、易出现假阳性和云同步，而且

5、还可根据癌细胞的异质性出现假阴性。 目前应用突变等位基因扩增(mutantalleliespecificamplification，masa )的pcr技术检测大肠癌和胰腺癌患者外周血中含有k-ras癌基因突变的肿瘤细胞球。2.3逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr )该方法在pcr的化学基基础上，从肿瘤特异性mrna序列中扩增出逆转录的dna片段。 rna检测的特异性目标mrna是基因变化后rna水平的异常，如突然变异(p53，ras )、缺失(brca1，brca2)、异构(cd44 )、扩增(erb- b2，egfr )的mucin、cytokeratin、er、mas 肿瘤特异性标记物m

6、rna，如cea、-hcg等。 1991年smith等3首先将rt-pcr应用于外周血黑色素瘤细胞球的检测。 此后，该技术被应用于消化系统肿瘤为ceamrna检查、乳腺癌为mammrna检查、肝癌为afpmrna检查、前列腺癌为psamrna检查等多种恶性实体肿瘤。 rt-pcr法具有较高的易感性和专一性，其易感性可达10-610-7，专一性的特点是其扩增蛋白大板块为mrna:rna在细胞球外环境下极不稳定， 检测到专一性mrna表达意味着存在肿瘤细胞球的mrna表达不受相应查询密码蛋白表达高低影响的引物设计可跨越两个不同的外显子，有助于避免整个染色体组的扩增，消除假阳性结果。 该方法受pcr

7、技术的限制，并且出现了假阳性和假阴性结果，因为rna易于被rna酶催化剂所分解。 为了提高rt-pcr的专一性和易感性，不断出现新的方法，加上rt-pcr，定量逆转录聚合酶链式反应(qpcr )、荧光定量逆转录聚合酶链式反应(fq-pcr )等增加。2.4流式细胞术(流动时间、fcm )该技术以流式细胞仪为工具测量分析混悬剂中的细胞球，具有快速准确的优点，筛选细胞球的速度为103104个细胞球/s。 使用fcm从血液中检测出上皮性肿瘤细胞球的价值在很大程度上依赖于能够分析的细胞球数4。 fcm不能提供有关细胞球形态的信息，但在鉴定和计数肿瘤细胞球方面比rt-pcr更可靠。 irene等人证明了

8、fcm是检测ctc数的有势力工具。 目前fcm需要取约50ml的外周血测定肿瘤细胞球的负荷，检查前特异性浓缩肿瘤细胞球，可大大提高检查易感性。2.5其他事项目前，ctc检查方法较多，但检查率仍有限，转移灶明确存在的患者的ctc阳性率可能较低。 引起这种情况的原因是不了解肿瘤细胞球的释放规律(ctc的释放可能是间歇性的)，而且循环中的肿瘤细胞球常常成群，在一点时间的检查中可能产生一定的偏差，但实际表达可能更高。 连续多次采样或增加采样量，可能会导致检出率上升。 并且，检查方法本身也有限度，有可能出现假阳性和假阴性。 建立对照，均衡、优化实验条件可使云同步浓缩肿瘤细胞球、激光扫描细胞球计数器等，从

9、而提高检测灵敏度和专一性，所选的免疫磁力分离技术为磁活化细胞球筛选(magneticactivatedcellseparation，macs ) vona等人。 基于上皮肿瘤细胞球的大小，建立了简单经济的分离计数ctc方法，利用上皮肿瘤细胞球大于外周血细胞的特点，经过滤分离富集。 此法灵敏度高，1ml血液中可检出一个肿瘤细胞球，适用于多种肿瘤。 在肝癌患者外周血肿细胞球的收集中，该方法的易感性高于rt-pcr方法，已经研究到与其他方法联用，检测效率和精准性显着提高。3、临床意义3.1常规体检(体外早期诊断):肿瘤在常规检查手段中，如影像学。 如果肿瘤不足1厘米，医生不认为它异常。 在国外发表的

10、报道中，与其说是1厘米，不如说是很多肿瘤在1毫米的血液中发现了循环肿瘤细胞球，从这一观点来看，早期诊断有着无法定值过低的意义。3.2辅助诊断手段：临床上确定一个患者是否肿瘤一直是一个难以明确回答的问题，这会被许多患者误诊。 例如胰腺癌在被诊断后多发现是晚期，为什么会这样呢？ 因为在初期阶段胰腺癌的诊断非常困难。 研究发现，目前在众多难以确诊的患者血液中，如果能检测出循环肿瘤细胞球，协助医生做出肿瘤诊断具有积极意义。3.3根据循环肿瘤细胞球个数判断治愈后和生存时间：经美国fda鉴定的易摩尼康(immunicon )公司多年的科研，对数百名患者进行了大量的科研，发现治疗后计算循环肿瘤细胞球的个数，

11、可以明确告诉患者是可以存活半年还是1年以上。 也就是说，循环肿瘤细胞球的应用首次能够以定量的指标告诉医生和患者生存时间。3.4个体化治疗：个体化治疗是指医生对每个肿瘤患者提出不同的治疗方案。 目前，在医院，如协和医院，很少有严密的个体化治疗方案，一般来说，医生根据经验决定给患者使用怎样的化疗药物，但不知道是否有效。 目前，国外正在兴起一种新的方法，即取出患者体内的肿瘤细胞球进行培养、培养，然后在体外进行药理实验。 因为化疗药物有很多，哪个最有效，不应该用经验来回答，而应该用事实来回答。 培养肿瘤细胞球后，用不同药物处理肿瘤细胞球，观察哪种化疗药物对肿瘤细胞球杀伤作用最大，并使杀伤作用最大的药物

12、用于患者，从而增加了治疗的目的。 随着ctc捕获技术的成熟，我们开始考虑是否可以将ctc作为个人化治疗的基础。 即捕获ctc进行培养，培养后进行药理实验，再在此基础上快速评价化学疗法药效。3.5快速判断化学疗法效果：目前无论在国内还是国外，给患者投用化疗药物后，做评估患者的疗效通常需要3个月。 因为肿瘤的大小只有3个月后才有明显变化。 我们的实验和国外发表的文章表明，经验给患者的化疗药物往往是无效的。 大多数情况下，3个月后肿瘤细胞球继续增长而不减少。 这对病人来说浪费了三个月的时间。 意味着对于肿瘤患者来说3个月最终有领便当的可能性。 随着ctc技术的成熟，患者不需要再等待三个月，只要等待三

13、周，通过测定ctc数量的变化，如果ctc数量显着下降，说明化疗药物有效，如果说明ctc数量增加，说明药物无效，医生就应该采用新的治疗方案。3.6体内药物耐受力检查：患者通常给药化疗药物最初是有效的，但有会儿后肿瘤患者的发病未连特罗尔。 我们可以很好地理解患者可能对药剂具有药剂耐受力。 抗体增多，容易产生药剂耐受力。 目前，肿瘤治疗患者是否出现耐受力，何时出现耐受力尚不清楚。 在许多情况下，当发现患者有耐受力时，病情已无法控制特罗尔。 随着ctc技术的成熟，我们可以进行动态观察，也就是患者的持续跟踪观察，一旦在动态观察过程中发现ctc的数量显着增加，医生就应该立即更换新的治疗方案。3.7最后检查

14、肿瘤复发：这是北京牌钢轨生物科技有限公司在协和医院和外院进行临床实验后，患者的反响最大的表兄弟。 目前，全世界肿瘤患者在接受治疗后，在恢复过程中肿瘤何时会复发？ 没有医生也无法解释。 随着ctc技术的成熟，发现肿瘤复发实际上是肿瘤转移的过程。 多数乳腺癌患者复发后转移到大脑，直肠癌患者复发后转移到肝脏。 即使原发部位被切除，肿瘤转移到其他部位，实际上表明是慢性肿瘤转移过程。 既然已经认识到肿瘤的复发与肿瘤转移过程直接相关，医生可以通过监测ctc直接监测患者肿瘤的复发。 也就是说，肿瘤的复发不是一夜之间，而是持续性肿瘤流血向远端转移的缓慢过程。 对于治疗过的患者，他体内的循环肿瘤细胞球应该只有极

15、少数，如果检测出他今后生活过程中循环肿瘤细胞球持续增加，就要提醒患者和医生，届时给患者适当的治疗，抑制ctc的增加。 ctc的增加很可能是肿瘤复发的前兆和复发过程。3.8其他人认识到ctc是药物靶向治疗的新靶向。 目前，国外许多大制药厂投入巨大资金研制肿瘤新药，在研发过程中不仅以实体肿瘤为靶向治疗的目标，还认识到以ctc为药物治疗对象。四结随着现代分子生物学技术的发展，ctc检测方法的易感性和专一性不断提高，特别是与细胞球浓缩技术的结合有助于早期发现ctc。 目前，在单一ctc水平上进行染色体组和mrna表达谱分析，有助于提高对ctc本质的认识。 总之，ctc检查有很好的应用前景，随着该研究领

16、域的发展，新的诊疗手段，特别是肿瘤的治疗将提高到新的阶段。1ghostseinar、caruso ne l bhattachcharyas.review 3360 polymerasechainrectiondectionofmicrometastaseandcirculartingtumorcells 330 前瞻性与现代化 j .诊断模型，1999，8336565-175。2布朗斯，潘特尔克.专业标准值ofmicrometastaticbonemarrowinvolvement j .brestcancerretreat，1998，52:201-216。3 smith b、selby p、southgate j、et al.detectionofmelanomacellsinperipheralbloodbymeansofreversetranscriptaseandp