《分子生物学第三次》PPT课件

1、1.真核生物与原核生物染色体的异同,真核生物染色体位于核仁内，一般在细胞有丝分裂过程中在光学显微镜下可见，而在细胞间期则为染色质，间期细胞经低渗处理溶胀破裂放出纤维串珠状的染色质。 原核生物的染色体位于拟核区，染色体环状,位置和形态：,原核生物染色体外裹着稀疏的蛋白质，这些蛋白质与DAN的折叠、复制、重组及转录有关。 真核生物DNA和蛋白质完全融合在一起，蛋白质与DNA的质量比为2：1，蛋白质包括组蛋白和非组蛋白 染色体的倍数： 原核生物染色体一般为单倍体，大多只带有单拷贝基因 每个基因序列几乎都与它所编码的蛋白质呈线性对应关系 真核生物除性细胞外染色体都是二倍体，每个基因都有2个拷贝,DNA

2、与蛋白质的关系,2.原核生物基因组,原核生物基因组特点： 基因连续，没有内含子 结构简练：DNA分子绝大部分用来编码蛋白质，小部分不转录DNA序列控制基因表达 存在转录单元：原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因丛集在基因组的一个或几个特定的部位，形成功能转录单元。并被一起转录为含多个mRNA的分子，叫多顺反子mRNA. 重叠基因：原核生物中的一些细菌和动物病毒中有重叠基因，即同一段DNA能携带两种不同的蛋白质信息。 如：X 174是一种单链DNA病毒，含有9个重叠基因，有几种情况： 一个基因完全在另一个基因里， 部分重叠，两个基因只有一个碱基重叠。 原核生物基因组具有单个复制起点,

3、染色体,DNA,蛋白质,组蛋白,非组蛋白,3.真核生物染色体中的蛋白质,蛋白质,组蛋白 H1、H2A、H2B、H3、H4 非组蛋白,组蛋白的特征： 进化上极端保守，尤其是H3、H4， 没有组织特异性，仅发现鸟类两栖类红细胞染色体不含H1而带有H5,精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白。 肽链上氨基酸分布不对称，碱性氨基酸分布在N端，疏水基团在C段。 组蛋白的修饰作用，包括甲基化，乙酰化、磷酸化、及糖基化 修饰作用发生在细胞周期的特定时期和组蛋白的特定位点上。,组蛋白修饰的生物学意义： 乙酰化、甲基化修饰能为相关调控蛋白提供附着位点，一般的乙酰化能选择性使某些染色质区域的结构从紧密变得松散，开放某些基

4、因转录，甲基化和可逆磷酸化的调节在信号转导过程中有重要的作用，是细胞生命活动的调控中心,4.真核生物基因组DNA 真核生物基因组比较大，包括核基因组和细胞器基因组 含有大量的重复序列， 功能DNA序列大多数被不编码非功能DNA隔开使基因组不连续 真核生物的基因为单顺反子 真核生物基因组有多个复制起点,5.核小体的结构： 核小体由H2A、 H2B、 H3、 H4各两分子组成的八聚体和大约200bp DNA组成，八聚体在中间，DNA 分子盘绕在外， H1在核小体的外面。 一个核小体中组蛋白和DNA比例是200bp DNA , H2A、 H2B、 H3 、H4 各两个，H1 一个。,DNA-核小体-

5、 螺线管-超螺旋-染色体 11nm 30nm 300nm 1400nm,7倍,6倍,40倍,5倍,200bp 约为68nm,染色质和核小体 DNA 和组蛋白有怎样的关系？ 几个有趣的发现： 染色质DNA的Tm值比纯DNA 高，说明染色质中的DNA可能与蛋白质分子相互作用 染色质状态下DNA聚合酶和RNA聚合酶催化DNA的复制和转录低于自由DNA的反应 DNA酶1对染色质DNA的消化慢于对纯DNA 的消化染色质在电子显微镜下为核小体组成的念珠状结构 核酸酶处理染色质得到片段的长度均为200bp的倍数,染色体上的非组蛋白： 非组蛋白约占组蛋白的60%-70%，种类约有20-100种之间，非组蛋白包

6、括酶类RNA 聚合酶及与细胞分裂有关的酶，核孔复合体蛋白、肌动蛋白等。 特性： 具有多样性和异质性，不同组织的细胞其种类和数量都不相同 对DNA具有识别特异性，能识别特异DNA序列，识别信息来源于DNA 序列本身，识别信息促在于双螺旋的大沟内 具有多种动能，参与表达调控，染色质高级结构的形成,部分动植物及细菌染色体数,C值矛盾,C值指的是生物单倍体基因组所含的DNA总量 C值矛盾是指基因数量与生物体进化程度不成正比,是人类基因组的200倍 是人类基因组的12倍,生命的特征是什么？ 生命的特征就是“活的”。生命现象最本质的内容就是自复制（自我繁殖和自我组织）。一个受精卵为什么变成一朵鲜花或一头大

7、象？生物的性状是由什么决定的？又是怎样代代相传的呢？人也是从受精卵逐渐发育成完整的个体的，而决定一个人将来长成什么样子的生命蓝图就储存在受精卵的DNA中。DNA（或RNA）携带着决定蛋白质结构的遗传信息而且代代相传，这就我们遗传信息的传递（即复制、转录和翻译）要讨论的内容。 为什么要讲复制？就是要了解： 子代DNA为什么能真实获得亲代DNA的遗传信息； 复制是怎样进行的？,第三节 DNA的复制 DNA复制可能的几种方式,全保留式 半保留式 混合式,密度梯度实验,实验结果支持半保留复制的设想,母代DNA,子代DNA,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA 的碱基 序列一致，即子代保留了亲代的全

8、部遗传信息， 体现了遗传的保守性,是物种稳定性的分子基础。,1.半保留复制的含义及意义,当DNA进行复制时，双螺旋结构解开成两条单链，各自作为模板合成与之互补的新链。在子代DNA双链中，一条是来自于亲代，另一条完全重新合成 。,3.DNA复制的起点方向和速度,生物的复制单位称为复制子。 DNA 复制由固定起始点开始，从一个DNA复制起点开始最终由这个起点起始的复制叉完成的片段。一个复制子有一个起点，细菌、病毒、线粒体DNA分子都为单个复制子，而真核生物可以同时有多个复制起点以既是说真核生物包含多个复制子,3x13bp直接重复序列,保守序列 GATCTNTTNTTTT,DnaA结合位点，4x9b

9、p,保守序列 TTATCCACA,大肠杆菌DNA复制起始点保守序列分布图 1、20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC的4 个9bp保守序列结合 2、在复制起始复合物的作用下使3x13bp重复 序列变形，形成开链,（1）起始位点的序列特征：,复制的起始,需要解决两个问题：,DNA解开成单链，提供模板,生成引物，提供 3-OH 末端,复制时DNA双链解开分成二股单链新链沿着张开的二股单链生成，复制中形成的这种 Y 字形的结构称为复制叉 双向等速复制为主,（2）复制叉（replication fork),(3)引物合成,Dna A,n, n, n, Dna B、 C和I,DNA拓扑异构酶,SS

10、B,3,5,3,5,真核生物的染色体庞大、复杂，有多个复制起始点，同时进行多个DNA片段的复制。,两个起始点之间的DNA片段，称为一个复制子（replicon）。,真核生物也是双向等速复制为主。,DNA聚合酶催化游离的脱氧核苷酸结合到新链3末端，使其不断延长,(4) 复制延长的过程,聚合反应的特点：,聚合反应具有方向性: 5 3 ,DNA 聚合酶不能催化两个游离 的脱氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷 酸的 3 - OH 逐个添加脱氧核苷酸，使核 苷酸链不断延长。,DNA 聚合酶,DNA聚合酶催化的反应,dTTP,3,(dNMP) n + dNTP (dNMP) n+1 + ppi,全称：依赖DN

11、A的DNA聚合酶 （DNA-dependent DNA polymerase,DDDP）,大肠杆菌DNA聚合酶I、II和III的性质比较,3 5 外切酶活性,5 3 外切酶活性,?,DNA损伤修复，冈崎片段引物去除,能辨认错配的碱基对，校对作用,核酸外切酶活性,前导链(leading strand) 顺着解链方向生成的子链，其复制是连续进行的，所得到一条连续片段的子链。,复制的半不连续性,3 ,5 ,3 ,5 ,解链方向,冈崎片段（ Okazaki fragment ）,3,5,随从链上不连续性片段的连接,（5）复制的终止,到达终止子序列（Ter）时，Ter-Tue复合物使DnaB不再将DNA

12、解链，阻止复制叉迁移。 相反方向的复制叉到达后停止复制 其间少量未复制序列由修复方式填补 拓扑异构酶IV作用下复制叉解体，释放子链。,真核生物复制的特点,真核生物的每条染色体上有多个复制起始点，如酵母17号染色体有400多个起始点， 真核生物的染色体在完成复制之前各个起始点的复制不能再开始 真核生物复制的起始需要起始原点识别复合物,真核生物的DNA聚合酶,DNA - pol ,引发和延伸链的功能,在复制延长中起主要作用,DNA损伤修复中起作用,在后随链复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用,在线粒体 DNA复制中起催化作用,DNA - pol ,DNA - pol ,DNA - pol ,DN

13、A - pol ,DNA 的半不连续复制,拓扑异构酶 DNA 解链酶 单链DNA结合酶 引发酶 DNA聚合酶 Rnase H 降解酶 DNA连接酶,DAN 复制为半保留复制 DAN 复制为半不连续复制 DAN 复制在特定的起始位点起始，多为双向等速进行复制 1.首先拓扑异构酶解开超螺旋 2.DNA解链酶解开DNA双链 3.单链结合蛋白与DNA单链结合 4.引物酶合成引物提供3-OH 5.DNA聚合酶合成新链，一条链为前导链，另一条链形 成冈崎片段 6.RNA酶将RNA引物水解，DNA聚合酶将却空缺按互补配对原则合成DNA,DNA连接酶将DNA连接，形成连续的新链,单链DNA结合蛋白（SSB）,

14、DNA拓扑异构酶,（DNA topoiSOmerase）,引物酶和引发体,引物酶 ( primase ),在模板的复制起始部位催化NTP的聚合, 形成短片段的RNA,这一小段RNA作为复制 的引物（primer），提供3-OH末端,使DNA-pol能够催化dNTP聚合。,依赖DNA的RNA聚合酶,引物酶与其他和复制有关的蛋白质形成的复合物。,引发体（primosome）,DNA复制的特点： 1.DNA 半保留复制 2.半不连续复制 3.需要引物 4.双向复制 5.有一定的复制起始点 6.DNA复制的保真性,与DNA复制有关的物质 1.四种脱氧核苷三磷酸 2.模板 亲代DNA 解链后分别作为模板

15、进行复制 3.引物合成酶 4.DNA聚合酶 5.DNA连接酶 6.DNA解旋酶 7.单链结合蛋白,2.DNA复制的几种方式 (1).线性DNA复制的方式 多数为双向复制，多个起始位点，复制叉处有眼状结构，称为复制眼。,(2).环状DNA复制方式 A.复制,B. D-环复制 单向复制 线粒体，叶绿体,C. 滚环复制也叫复制,DNA 复制的调控,原核生物的调控，DNA链的延伸速度恒定，复制叉的数量决定细胞生长和增值速度。 ColEI 质粒DNA 的复制调控,DNA编码两个负调控因子，Rop 蛋白和反义RNA,RnaseH,真核细胞DNA 的复制调控,真核细胞的生活周期分为4个时期G1复制预备期S、

16、复制期G2、有丝分裂准备期、M有丝分裂期,真核生物复制有3个水平的调控 细胞生活周期水平调控，决定细胞停留在G1期还是进入S期 染色体水平，决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序起始复制 复制子水平调控，决定复制的起始与否,真核细胞DNA 的复制调控,真核细胞的生活周期分为4个时期G1复制预备期、S复制期、G2有丝分裂准备期、M有丝分裂期,真核生物复制有3个水平的调控 细胞生活周期水平调控， 决定细胞停留在G1期还是进入S期 染色体水平，决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序起始复制 复制子水平调控，决定复制的起始与否,聚合酶链式反应PCR,聚合酶链式反应（Poly

17、merase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术 典型的PCR由（1）高温变性 （2）引物与模板退火； （3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93-94）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72将单核苷酸从引物的3端开始掺入，以目的基因为模板从53方向延伸 PCR能在（pg）水平起始DN

18、A混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离 克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建。,课后复习题： DNA半保留复制 DNA 的半不连续复制 复制子 复制叉 如果细菌环状染色体的复制是双向的，并且从固定的复制起点开始，每个复制差以16um/min的速度移动，细菌染色体长1280um,完成整个染色体复制需要多少时间？当细菌在营养丰富的培养基每20min 分裂一次，也就是说第一轮复制尚未完成就开始第二轮复制，此时染色体有几个复制叉？,课后复习题： DNA半保留复制 DNA 的半不连续复制 复制子 复制叉 如果细菌环状染色体的复制是双向的，并且从固定的复制起点开始，每个复制叉以16um/min的速度移动，细菌染色体长1280um,完成整个染色体复制需要多少时间？当细菌在营养丰富的培养基每20min 分裂一次，也就是说第一轮复制尚未完成就开始第二轮复制，此时染色体有几个复制叉？,DNA损伤的原因及后果,电离辐射,可见光,氧自由基,H+,烷化剂,8-oxoG,P/P,复制错误,核苷类似物,mC,U,DNA损伤的后果,一、DNA 的修复,大肠杆菌中DNA的修复系统,常见的DNA损伤及其修复机制,1.错配修复,大肠杆菌 DNA 甲基化位点 新合成的DNA,Mis-pa