第二章+Part+3+基因工程与食品产业

1、第二章 基因工程与食品产业 第一节 基因工程概述 第二节 基因工程的原理及基本技术 第三节 基因工程在食品工业中的应用,第二章 基因工程与食品产业 第一节 基因工程概述 第二节 基因工程的原理及基本技术 第三节 基因工程在食品工业中的应用,第一节 基因工程概述 一、基因工程的概念及发展 1、基因工程（gene engineering)： 所谓基因工程，就是利用DNA体外重组或扩增技术从供体生物基因组中分离感兴趣的基因或DNA片段，或是经过人工合成的方法获得基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应产生重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程。,基因工程(gene en

2、gineering)常和以下名称混用: 遗传工程(genetic engineering)； 基因克隆(gene cloning); 分子克隆(molecular cloning); 基因操作(gene manipulation); 重组DNA技术(recombination DNA technique)； 克隆(clone): 作名词时是指含有某目的DNA片段 的重组DNA分子或含有该重组分子 的无性繁殖系。作动词时是指基 因的分离与重组过程。,2、基因工程的发展概况 历史回顾： 70年代初，DNA已可在体外被随意拼接并转回到细菌体内遗传和表达 。今天，人们在超市货价上可以买到保质期很长的转

3、基因土豆，“多利”克隆绵羊走进实验室，基因工程正在使整个人类生活方式发生重大变革。 2000.6.26宣告人类基因组“工作框架图”绘制完毕。 目前还有许多有价值的微生物，动物，植物的测序工作正在进行中。,人类基因组计划 这一价值30亿美元的计划旨在对人类基因组进行精确测序，发现所有人类基因并确定其在染色体上的位置，明确所有基因的结构和功能，破译人类全部遗传信息，使人类能够在分子水平上全面认识自我。,2000年，法国科学家利用基因技术“制造”出了一只可以发出绿色荧光的兔子“Alba”。应用了受精卵显微注射技术，从水母身上采集了荧光蛋白，基因改良后，使它的发光率比原先提高了两倍，再将该基因植入到了

4、兔子的受精卵中，由此培养出了会发光的兔子Alba。,二、工具酶和基因载体 1、基因工程的工具酶 限制性内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 碱性磷酸酯酶 S1核酸酶 逆转录酶,限制性内切酶（RE表示） 分类：,I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS位于染色体上，三 个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM （腺苷甲硫氨酸）。 II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在. coli中这两 种基因位于质粒上。 III型：修饰酶与型酶相同，hsd与hsd基因产物结合成 一亚单位，限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有II型限制酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于

5、基因工程中。,限制性内切酶的定义、命名 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指 II型限制酶。 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编 号、分离顺序。 例如：Hind前三个字母来自于菌种名 称H. influenzae，“” 表示菌系为型 血清型；“”表示分离到的第三种限制酶。,II型限制酶的特点 表2.1 识别顺序和酶切位点；（位点特异性酶） 识别-8个相连的核苷酸； 富含； 对称性；（回文结构） 切点大多数在识别顺序之内，也有例外； 限制酶切后产生两个末端，-和-。,末端种类： -端突起，个数为或个核苷酸； -端突起，个数为或个核苷酸； 平齐末端。,限制酶切末端特点 5-突起末端：

6、,EcoRI 5GAATTC3 5GOH PAATTC3 3CTTAAG5 3CTTAAP HOG5,3-突起末端：,Pst I 5CTGCAG3 5CTGCA G3 3GACGTC5 3G ACGTC5,平端：,SmaI 5CCCGGG3 5CCC GGG-3 3GGGCCC5 3GGG CCC5,限制酶的用途 DNA重组； 限制酶（物理）图谱绘制； 突变分析（RFLP分析）； 限制酶的部分酶切与完全酶切。,DNA 连接酶 T4 DNA连接酶 特点：只连接ds -DNA分子，要求3-羟基和5-磷酸基 用途：用于不同DNA分子的连接，形成重组DNA分子 1) 相同或相容粘性末端的连接 2) 平

7、整末端的相连,DNA聚合酶 E.coli 的DNA聚合酶系统 催化53方向合成DNA Pol I 参与DNA修复 具35和53外切酶活性 pol II 同上 具35外切酶活性 pol III 参与DNA复制 具35和53外切酶活性,E.coli polI的特点： 1） 具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋 白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具35外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段, polIK) 2） 聚合酶活性，53, 要求3-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响 3） 外切酶活性 E.coli polI用途： 1） 除去3-端突

8、起的单链DNA 2） 补齐5-突起端 3） 合成第二条cDNA链 4） 切口移位制备探针 其中用途2) 和3)常用大片段,2、 基因工程载体,载体要求： 在宿主细胞中能独立自主地复制； 易从宿主细胞中分离纯化； 其分子中有一段不影响自身扩增的非必需区域， 插在其中的外源基因可以进行复制和扩增。,基因工程载体: 质粒载体plasmid: pBR322, pUC18/19； 噬菌体载体phage: , M13, SV40； 柯斯质粒载体cosmid: 人工组建，兼具、质粒优点。,大肠杆菌质粒分子结构,大肠杆菌载体pBR322结构图,三、基因工程理论基础,1、不同基因具有相同的物质基础； 基因是一个

9、具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。,2. 基因是可切割的； 限制性内切酶（Restriction Enzyme），如EcoRI，HindIII等。,3. 基因是可以转移的； 4. 多肽和基因之间存在对应关系；,证明基因与氨基酸之间存在直接对应关系的第一个直接证据,5. 遗传密码是通用的；,6. 基因可以通过复制把遗传信息传给下一代。 所谓“中心法则”，是指遗传信息在细胞内的生物大分子之间转移或传递的基本法则。,第二章 基因工程与食品产业 第一节 基因工程概述 第二节 基因工程的原理及基本技术 第三节 基因工程在食品工业中的应用,第二节 基因工程原理及基本技术一、基因工程的基本原理,(1

10、)利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复 制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分 子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提 高其宏观表达水平。这里涉及到DNA分子拷贝复制以及 稳定遗传的分子遗传学原理。 (2)筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子 等基因的转录调控原件，并将这些原件与外源基因精 细拼接，通过强化外源基因的转录提高其表达水平。,(3)选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译 调控原件，强化受体细胞中蛋白的生物合成过程。这些涉 及到基因表达调控的分子生物学原理。 (4)基因工程菌（细胞）是现代生物工程中的微型生物反应 器，在强化并

11、维持其最佳生产效能的基础上，从工程菌 （细胞）大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微 型生物反应器的增值速度和最终数量，也是提高外源表 达产物产量的主要环节，这里涉及的是生物化学工程学 的基本理论体。,二、基因工程基本技术 基因工程主要内容 基因工程的实现主要分为四个步骤： 第一步：目的基因的分离或制备：人工分离生物基因组群中 目的基因及内切酶定位切 割或人工酶促合成； 第二步：重组DNA：选择载体及目的基因与载体基因重组； 第三步：导入与表达：重组DNA导入受体细胞，目的基因表 达出目的效应和性状； 第四步：筛选、鉴定：筛选、鉴定出含有外源目的基因的菌 体或个体。,（1）从供体细胞中分离

12、出基因组DNA，用限制性核酸内切酶 分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分 子切开（简称“切”）；,（2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体 上，形成DNA重组分子（简称“接”）；,（3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中 （简称“转”）；,（4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合 到受体细胞的基因组中（简称“增”）；,（5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效表达的基因 工程菌或细胞（简称“检”）。,可见，基因工程的上游操作过程可简化：,切 接 转 增 检,基因工程基本技术 1、目的基因的获得与序列分析 1.1 目的基因的获得 鸟枪法

13、 物理化学法 化学合成法 酶促逆转录合成法 PCR扩增法 1.2 DNA序列测定 化学降解法 酶促法 自动化测序,2、目的基因与载体的连接（重组与克隆） 亚克隆 黏性末端连接 平段连接 同聚物加尾连接,DNA重组技术的基本过程,载体系统大肠杆菌质粒,外源DNA系统,内切核酸酶,内切核酸酶,“退火”,DNA连接酶,重组质粒,转化,受体系统,感受态细菌,复制,染色体,“工程菌”,重组质粒,DNA重组技术的基本过程,3、重组DNA向受体的转化 转化反应 磷酸钙沉淀法 体外包装转染法 共转化 电转化法 基因枪法 微注射技术法 脂质体导入法,4、重组体筛选与外源基因的鉴定 重组体的筛选 重组体的鉴定,5

14、、基因食品 转基因食品是利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到其他物种中去，使其性状、营养品质、消费品质向人类所需要的目标转变。 转基因食品大致可以分为两大类，一是改造现有的基因，使一些性状不表现出来；另外一类是导入其他的基因，从而产生新的性状。 6、转基因动物 转基因动物 （transgenic animal）是通过遗传工程的手段对动物基因组的结构或组成进行人为的修饰或改造，并通过相应的动物育种技术使得这些经修饰改造后的基因组在世代间得以传递和表现。 技术体系的组成：（1）克隆目的基因；（2）设计遗传修饰策略（包括载体系统的构建等）；（3） 按育种程序进行工程动物的选育和建系,动物体细胞

15、克隆技术为生长蛋白类药物、器官移 植、挽救珍惜濒危动物及培育优良品种奠定基础； 1997年，Wilmut等用山羊胚胎的核转入去核未受精的卵母细胞，克隆了“Dolly羊”； 转基因动物成功引导了一种新型的制药工业，利用转基因山羊，绵羊和乳牛的乳汁生产治疗人类疾病的蛋白类药物；另外克隆经过修饰的猪，为人体器官移植提供外源器官。 我国上海转基因研究中心和陕西的中国杨凌克隆动物基地也成功克隆了山羊。,转基因动物,第一例转基因动物转基因鼠,体细胞克隆产生的多利羊,大棚种植的转基因(抗青枯病)马铃薯,基因工程生产的超级小鼠(与正常小鼠)比较,第二章 基因工程与食品产业 第一节 基因工程概述 第二节 基因工程的原理及基本技术 第三节 基因工程在食品工业中的应用,第三节 基因工程在食品产业中的应用 利用基因工程改造食品微生物 利用基因改善食品原料的品质 利用基因工程改进食品生产工艺 利用基因工程生产食品添加剂及功能性食品,利用基因工程改造食品微生物 1、改良微生物菌种基因工程菌 例：面包酵母菌促进发酵 啤酒酵母菌 2、微生物酶分子的人工进化,基因工程应用于发酵菌种的改良,利用基因工程改善食品原料的品质 1、蛋白质类食品原料 2、油脂类食品原料 3、碳水化合物类食品原料,利用改进食