第02章-酶分析法

1、第2章酶分析，第1节酶分析的基本知识，1.1两种酶分析，1.2酶分析的特征，1.3酶分析的意义，第2章酶分析，第1节酶分析的基本知识，第2节酶活性的测定，第3节酶分析，第4节酶循环分析，第5节固定化酶在酶分析中的应用。具有蛋白质性质的酶是高效、高特异性的生物催化剂，与生命活动密切相关。因此，酶学在生产实践的基础理论研究中起着非常重要的作用。酶分析法是重要内容之一，也是目前发展迅速的一个领域。酶的选择性及其在低浓度下催化底物反应的能力对化学分析非常有用。酶促反应已被用于测定底物、活化剂、抑制剂和酶。在19世纪中叶，酶被用来测定糖类。20世纪40年代初，沃伯格提出了一种基于还原型辅酶的测定NAD和

2、NADP的分光光度法。最新进展是电化学方法和荧光方法的应用。酶分析已经成为公认的分析技术。1.1酶分析的两种类型是：以酶为分析对象，根据需要测量样品中的酶含量或活性，这通常称为“酶活性测量”。另一种方法是用酶作为分析试剂，测定样品中用一般化学方法难以检测的物质，如酶的底物、抑制剂、激活剂和辅因子，一般称为“酶分析法”。虽然这两种方法的检测对象不同，但其原理和方法都是基于酶能够特异、高效地催化化学反应，通过测量酶的反应速度可以检测相应物质的含量。有必要选择合适的反应条件和测定方法。1.2酶分析的特征选择性高。原则上，一种酶只能催化一种反应，或者只能催化一种特定的化合物或作用于特定的化学键。这是由

3、酶本身的高度特异性决定的。高灵敏度。一般可达10-7毫升/升.结合荧光法，最高可达10-9mol/L.反应速度快，条件温和。大多数酶促反应可以在30分钟内完成。反应条件温和，例如在常温、常压和接近中性的酸碱度下，反应速度非常快。酶的量很少，所以很经济。精确度一般。主要是由于微量移液器的误差，如量低于1ul，取样误差较大。这也与组合方式有关。适用范围有一定的限制。仅测定酶、底物、辅酶、激活剂或抑制剂。简单程度很差。有必要进行酶学知识的操作培训，这通常需要最大限度地减少人为错误并使所有反应系统条件尽可能一致。例如样品添加、温度、反应时间等。要求准确。确定最佳反应条件(如温度、酸碱度等)非常重要。)

4、。一个熟练的酶学家会考虑各种因素，设计的实验是合理的和可重复的；没有受过特殊训练的人容易犯错误。1.3酶分析的意义酶的应用大致可分为四个方面：(1)制造某些产品；(2)去除某些物质；(3)鉴定化合物；(4)确定物质。(1)和(2)被广泛使用。例如，可的松由酶法生产，奶酪由凝乳酶生产，果汁由果胶酶澄清。(3)和(4)属于酶分析的范畴。酶分析迅速发展的原因之一是，由于酶制剂工业的发展，可以容易地获得各种酶制剂。第二个原因是由于酶应用形式的发展。由于近十年来酶固定化技术的快速发展，酶的重复和连续使用成为可能。固定化酶有很多种。一方面，它们与自动测定技术相结合，促进了自动酶分析的快速普及。另一方面，它

5、正在被进一步简化，或者它可以被制成含有酶的试纸或制成酶试剂包装出售，可以直接使用例如，用葡萄糖氧化酶(EC1134)测定血糖是临床检查中常用的方法，某些酶的测定也是临床诊断的重要指标。在第二节中，酶活性的测定，2.1酶活性单位和初始反应速度，2.2反应条件的测定，2.3测定方法，1酶活性的概念，2.1酶活性单位和初始反应速度，2.1.1酶量通常用酶活性单位表示。酶活单位是指在一定条件下使酶反应达到一定速度所需的酶量。酶含量可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂的酶单位数来表示。1959年，国际生物化学协会酶委员会接受了拉克的建议，采用“国际单位”来表示酶的活性。国际单位：25，最佳酸碱度，最佳底物浓度

6、，每分钟催化1L底物反应的酶量。当底物是蛋白质、多糖等时。包括可被酶作用的多个键或基团，酶单元可通过催化作用的基团或键的微小变化来表达；对于反应来说，酶单位可以通过两微摩尔的来计算.1972年，酶委员会提出了一个新的单位Katal。在确定的最佳反应条件下，每秒钟催化1摩尔底物变化所需的酶量为1Kat。1Kat=60106IU .在实际工作中，为了简单起见，人们经常使用自己习惯的单位。有时它甚至可以直接用测量的物理量来表示。例如，酶单位表示为光吸收的变化值。当估计酶制剂的纯度时，使用比活性，也就是说，当酶是高纯度的并且酶的分子量和每个酶分子上的活性中心的数量已知时，它可以用分子活性或转化率(TN

7、)来表示。TN代表在最佳条件下每分钟每种酶分子或活性中心的催化底物分子(或相关基团)的数量。这个单位的意思是，它可以用来估计和比较酶的催化效率。2.1.2初始反应速度酶促反应速度可以用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。“酶反应进程曲线”可以通过绘制产物或底物相对于时间的变化来获得，该曲线的斜率代表酶反应速度。酶活性测定的目的是通过测量酶的反应速度来获得酶的浓度或含量。测得的反应速度和酶浓度之间必须存在线性比例关系，这是检验酶反应和测定系统是否合适和正确的标准。2.2反应条件的确定选择反应条件的基本要求是所有待测的酶分子应能正常工作。也就是说，在反应体系中，除了待测酶的浓度是影响反应速度的

8、唯一因素外，其他因素都应处于最佳条件。2.2.1基材(包括合成基材)在物理和化学性质上最好不同于产品。一些底物和产物在酶的作用下具有这样的特性，如脱氢酶的NAD(P)和NAD(P)H；另一些需要处理色源或荧光源的底物，产品在酶作用后会产生颜色或荧光。例如，对硝基苯磷酸可用于磷酸酶测定。底物浓度为了使酶的反应速度不受其限制，反应体系应使用足够高的底物浓度。标准是Km，例如，s=100Km，因为在这种情况下反应速度可以达到最大速度的99%。大多数酶具有相对特异性。通常，在可被其作用的各种底物中，选择具有小Km的底物作为测定的底物。当底物表现出高底物浓度抑制，或具有低溶解度，或毒性，或使用高浓度太昂

9、贵，且没有其它合适的底物可替代时，只能根据具体条件选择合适的底物浓度。并测定了该浓度下酶反应的动力学水平。例如，酵母中的蔗糖受到高蔗糖浓度的抑制，因此通常选择蔗糖浓度约为5%进行测定，并且反应是零级的。2.例如，乳酸脱氢酶的反应在pH 7时向乳酸形成方向发展，在pH10时倾向于形成丙酮酸。在测定酶活性时，应注意选择合适的反应酸碱度，并将反应保持在此范围内。某些酶反应的最佳酸碱度可能会因反应温度和底物浓度而异。例如，碱性磷酸酶在25、30和37时的最适酸碱度分别为10.3、10.1和9.9。酶反应缓冲体系中离子的pK值应接近待调节的酸碱度。磷酸盐缓冲液适用于酸碱度低于7.5的反应体系，Tris缓

10、冲液适用于酸碱度高于7.5的反应体系。甘氨酸-甘氨酸二肽在pH8时是一个很好的缓冲体系。不同的缓冲离子可能影响酶的活性水平，甚至最适的酸碱度。缓冲离子也可能与酶活性的主要成分形成复合物，导致酶活性的抑制。例如，磷酸可以与多价阳离子如Ca2结合，硼酸可以与各种有机化合物如呼吸链中间体结合，从而抑制相应的酶活性。2.2.3温度直接影响化学反应本身的速度、酶的稳定性、酶的构象和酶的催化机理。如果温度变化1，速度差异可能超过10。为了获得高度可重复的结果，温度变化应控制在0.1以内。1961年，生化协会建议将酶的反应温度定为25，1964年又建议改为30；国际临床化学联合会也推荐30种。然而，许多临床

11、化学家经常使用37作为酶反应温度。2.2.4辅因子一些酶需要金属离子，而另一些需要相应的辅酶物质。在反应体系中，我们要满足酶对这些辅因子的需求，在添加这些物质时也要注意它们的特异性，有些激活剂在高浓度下可能有抑制作用。为了提高酶在反应体系中的稳定性，有时需要一些相应的物质。例如，巯基乙醇、二硫苏糖醇等可以加入到巯基酶中。为了防止待测酶在样品制备和反应过程中被蛋白酶降解，通常添加蛋白酶抑制剂。2.2.5样品许多待测样品通常包含各种干扰因素，例如可能作用于同一底物或产品的其他酶。因此，在确定之前，有必要检查系统中是否存在这些干扰因素。同时，采用不同的测定方法，同时检测底物和产物的变化，然后观察测定

12、结果是否一致。通过这些比较分析，确定是否存在干扰。GPT或GOT可以催化氨基的转移。该测定方法与脱氢酶反应相结合。前者可与乳酸脱氢酶(LDH)偶联，后者可与苹果酸脱氢酶(MDH)偶联，然后测量反应过程中340纳米处NADH光吸收的减少。在这些样品中，如果含有谷氨酸脱氢酶(GluDH)，可能会发生干扰。反应平衡趋向于形成左旋谷氨酸，这也导致在340纳米处光吸收的减少。葡萄糖脱氢酶在正常血清中很少见，但在脑、肝和其他组织中极其丰富。在某些病理条件下，血清中这种酶的活性可能显著增加。酶反应需要NH4，其Km非常大。如果反应体系可以避免NH4，这种干扰可以消除。同时，进行了空白试验。2.2.6空白和对

13、照空白是指由混杂反应和自发反应引起的变化，提供未知因素的影响。空白值可以通过不添加酶、底物或两者都添加的反应系统获得，但是酶是预先失效的。对照是指用纯酶或标准酶制剂测定的结果，主要用作比较或校准的标准。2.3测定方法测量方法包括取样法和连续法。取样方法：在酶反应开始后的不同时间从反应体系中取出一定量的反应溶液，用适当的方法停止反应，然后分析产物和底物的化学性质，得到单位时间内酶反应的变化量。连续法：基于th2.3.1光吸收测量是一种基于产品和基质在某一波长或波段的明显特征吸收差异的连续观察方法。光学吸收测量被广泛使用。几乎所有的氧化还原酶都可以用这种方法测定。实施例1:脱氢酶的辅酶NAD(P)

14、H在340纳米处有吸收峰，但氧化形式没有。实施例2:细胞色素氧化酶的底物是细胞色素c，其在550纳米处的吸收系数在还原状态下为2.81104厘米/摩尔，在氧化状态下为0.80104厘米/摩尔。这种光吸收的差异也可用于测定。一些氧化还原酶很难获得天然供体和受体，因此可以使用简单的人工供体和受体(见下表)。这可以通过光吸收来确定-还有那些催化双键饱和或双键形成的酶反应，以及那些催化环状结构变化的酶反应。实施例1:富马酸酶催化反应，富马酸在300纳米处有很强的光吸收，而苹果酸没有。实施例2:尿酸氧化酶催化尿酸氧化成尿囊素。尿酸在290纳米处被吸收，但尿囊素不被吸收。光吸收法的特点是灵敏度高(可以检测

15、到nmol/L水平的变化)，简单易行，一般可在短时间内完成测定。光吸收法被广泛使用。除上述氧化还原酶外，还有许多激酶(转移酶)、酯酶、肽酶等。在这种方法中被广泛使用。2.3.2荧光分析如果酶反应的底物或产物具有荧光，荧光强度的变化率可用作酶反应速度的量度。用这种方法可以测定两种酶反应：一种是脱氢酶反应，另一种是其他反应，它们的底物在酶反应过程中有荧光变化。例如，NAD(磷)氢的中性溶液发出强烈的蓝白色荧光(460纳米)，而NAD(磷)不发出。另一种是使用荧光源底物的酶反应。例如，脂肪酶可由二丁基荧光素测定，二丁基荧光素不发荧光，但水解后释放荧光素。荧光分析的优点：其灵敏度比光吸收分析高23个数

16、量级，特别适合于酶或底物量极低时的快速酶分析。与此相关的是荧光光谱和荧光偏振测量。近年来，它们被广泛用于研究酶的作用机理。荧光测量的缺点荧光读数和浓度之间没有正比关系。而且往往是由于温度、散射、仪器等测定条件。因此，如果你想用一个确定的单位来表示酶的活性，你应该首先准备一个校准曲线，然后根据这个曲线精确地量化它。这种方法容易受到其他物质的干扰。重铬酸钾等物质经常会夺取能量并降低荧光强度；有些物质，如蛋白质，可以吸收和发射荧光，这种干扰在紫外区特别明显，所以最好用可见光测量荧光，特别是红色荧光。2.3.3电化学方法具有较高的灵敏度和准确度，可与光学方法相比。测量系统中有一些物质，不会影响结果。这

17、种方法需要一定的仪器和设备。最常见的离子选择电极法是用玻璃电极测量酸度的变化。可用于产酸反应的测定。这种方法操作简单，但有两个缺点：第一，随着反应的进行，酸碱度会不断变化，酶的活性也会变化；其次，测量系统的酸碱度取决于介质的缓冲能力，而蛋白质是一种高缓冲物质，待测的粗样品往往含有大量的惰性蛋白质，因此很难保证恒定的缓冲强度，测量结果也很难准确。连续滴定或恒酸滴定可以克服上述困难。所谓恒酸滴定是指在反应过程中，不断向反应体系中加入酸或碱以保持酸碱度恒定，反应速度由加入酸或碱的速率来表示。恒酸滴定仪就是为满足这一需求而设计的一种精密测量仪器。它能自动加入酸和碱来控制酸碱度，并记录下反应时间可以进行选择