第10章 吸光光度法.ppt

1、2020/7/16,1,第10章 吸光光度法,10.1 物质对光的选择性吸收 和光吸收的基本定律 10.2 分光光度计及吸收光谱 10.3 显色反应及影响因素 10.4 吸光光度分析及误差控制 10.5 其它吸光光度法 10.6 吸光光度法的应用,2020/7/16,2,依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法,主要有: 红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围2.51000 m ,主要用于有机化合物结构鉴定。,吸光光度法,2020/7/16,3,紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围200400 nm（近紫外区） ，可用于结构鉴定和定量分析。 可见吸收光谱：电子跃迁光

2、谱，吸收光波长范围400750 nm ，主要用于有色物质的定量分析。,2020/7/16,4,10.1.1 物质对光的选择性吸收 1.光的基本性质 白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光 单色光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成) 可见光区：400-750 nm 3.1-1.7eV 紫外光区：近紫外区200 - 400 nm 远紫外区10 - 200 nm （真空紫外区）,10.1 物质对光的选择性吸收和光吸收的基本定律,2020/7/16,5,硫酸铜溶液，吸收黄光 呈现蓝色.,青蓝,橙,高锰酸钾溶液，吸收绿光, 呈现紫色。,互补光,2020/7/16,6,2.吸收光谱产生的原因,当光子

3、的能量与分子的E匹配时，就会吸收光子 E=hu=hc/l,2020/7/16,7,3.物质对光的选择性吸收,M + 热,M + 荧光或磷光,E = E2 - E1 = h 量子化 ；选择性吸收; 分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同； 用不同波长的单色光照射，测吸光度 吸收曲线与最大吸收波长 max；,M + h M *,基态 激发态 E1 （E） E2,2020/7/16,8,10.1.2 光吸收定律朗伯-比尔定律,吸光光度法的理论依据，研究光吸收的最基本定律,I0 = Ir + It + Ia,I0 = It + Ia,T = It / I0 , T: 透射比或透光度 A=lg

4、(I0 / It )lg(1/T), A:吸光度,朗伯定律（1760年）：光吸收与溶液层厚度成正比 比尔定律（1852年）：光吸收与溶液浓度成正比,2020/7/16,9,当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成正比关系朗伯比尔定律 数学表达：Alg(1/T)=Kbc 其中，A:吸光度，T:透射比， K:比例常数，b:溶液厚度，c:溶液浓度,2020/7/16,10,注意,2.LambertBeers Law也适于均匀非散射的g、s，适于紫 外光和红外光；3.当溶液中含有多种吸光物质时：,即：吸光度具有加和性（非常有用的性质）。,1.平行单色光 均相

5、介质 无发射、散射或光化学反应,2020/7/16,11,(1) 摩尔吸光系数 e,灵敏度表示方法,A = e bc,A = Kbc,c: mol/L,e 表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时溶液的吸光度。单位： (Lmol-1 cm-1),c: g/L,A = abc a: 吸光系数,a相当于浓度为1 g/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度(Lg-1cm-1 ）,2020/7/16,12,（2）Sandell 灵敏度 S,S的原含意：人眼借助颜色变化，在单位截面积（cm2）液柱内能检出物质的最低含量（g/cm2）。 若借助仪器，当仪器的检测极限为A=0.001（规定

6、）时，单位截面积光程内能检出物质的最低含量称之“Sandell灵敏度”S.,S与的关系： A=b c=0.001, 则: b c=0.001/,又,将（1）式代（2）中得： S = M/,2020/7/16,13,摩尔吸光系数的讨论,（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数； （2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；,2020/7/16,14,（3）可作为定性鉴定的参数； （4）同一吸收物质在不同波长下的值是不同的。在最大吸收波长max处的摩尔吸光系数，常以max表示。max表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反

7、映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。,2020/7/16,15,（5）max越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。105：超高灵敏； =(610）104 ：高灵敏； 2104 ：不灵敏。 （6）在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。,2020/7/16,16,例：氯磺酚S测定钢中的铌 50ml容量瓶中有Nb30g，用2cm比色池，在650nm测定光吸收，A0.43,求S. (Nb原子量92.91)。,3.3104 Lmol-1cm-1,2020/7/16,17,10.2 分光光度计及吸收光谱,10.2.1 分光光度计,202

8、0/7/16,18,2020/7/16,19,光度计及其基本部件,2020/7/16,20,在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。,可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在360800 nm。 紫外区：氢、氘灯。发射185400 nm的连续光谱。,1. 光源,2020/7/16,21,2. 单色器,入射狭缝：光源的光由此进入单色器；,色散元件：将复合光分解成单色光,将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任意波长单色光的光学系统。,准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；,2020/7/16,22,棱镜： 光的折射原理 光栅：光的

9、衍射和干涉原理,2020/7/16,23,3.吸收池,在紫外区须采用石英池，可见光区一般用玻璃池。,吸收池（比色皿）用于盛放吸收溶液。,主要有 石英池和玻璃池两种。,规格为； 0.5、1.0、2.0、3.0cm,2020/7/16,24,4. 检测系统,将光强度转换成电流来进行测量。光电检测器。 要求：对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应， 产生的光电流应与照射于检测器上的光强度成正比。,光电管 光电倍增管 光二极管阵列,2020/7/16,25,Al作图得 吸收曲线 (吸收光谱),10.2.2 吸收光谱,2020/7/16,26,最大吸收波长 lmax= 525nm。 吸收曲线是一种特征曲

10、线 在最大吸收波长附近，吸光度测量的灵敏度最高,2020/7/16,27,参比液的选择,原则：,扣除非待测组分的吸收,A （样） = A （待测吸光物质） + A （干扰）+ A （池）,A （参比） = A （干扰）+ A （池）,2020/7/16,28,以显色反应为例进行讨论,M + R = M-R,max,若欲测 M-R 的吸收,max,2020/7/16,29,10.3 显色反应及影响因素,要求： a. 选择性好 b. 灵敏度高 (104) c. 产物的化学组成稳定 d. 化学性质稳定 e. 反应和产物有明显的颜色差别 (l60nm),没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有色

11、化合物再测定 显色反应,1、 显色反应,2020/7/16,30,络合反应,氧化还原反应,2、 显色反应类型,2020/7/16,31,离子缔合反应,成盐反应,2020/7/16,32,褪色反应 Zr(IV)-偶氮胂III络合物测定草酸,吸附显色反应 达旦黄测定Mg(II),Mg(OH)2吸附达旦黄呈红色,2020/7/16,33,3、 显色剂,无机显色剂: 过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾,有机显色剂： 偶氮类：偶氮胂III,2020/7/16,34,三苯甲烷类 三苯甲烷酸性染料 铬天菁S,三苯甲烷碱性染料 结晶紫,2020/7/16,35,邻菲罗啉类：新亚铜灵,肟类：丁二肟,2020/7/16,

12、36,4、 多元络合物,混配化合物 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸 V-PAR-H2O 离子缔合物 AuCl4-罗丹明B 金属离子-配体-表面活性剂体系 Mo-水杨基荧光酮-CTMAB,2020/7/16,37,5、 影响因素,a 溶液酸度（pH值及缓冲溶液） 影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变l 影响待测离子的存在状态，防止沉淀 影响络合物组成,2020/7/16,38,b、 显色剂的用量,稍过量，处于平台区,c、 显色反应时间,针对不同显色反应确定显示时间 显色反应快且稳定；显色反应快但不稳定； 显色反应慢，稳定需时间；显色反应慢但不稳定,d 、显色反应温度,加热可加快反应速度，导致显色

13、剂或产物分解,2020/7/16,39,e、 溶剂,f 、干扰离子,有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率,消除办法： 提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态 选择合适参比 褪色空白(铬天菁S测Al，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰) 选择适当波长,2020/7/16,40,10.4 吸光光度分析及误差的控制,选择显色反应 选择显色剂 优化显色反应条件 选择检测波长 选择合适的浓度 选择参比溶液 建立标准曲线,测量条件选择,2020/7/16,41,1 、测定波长选择,选择原则：“吸收最大，干扰最小”,灵敏度,选择性,2020/7/16,42,2、 标准曲线制作,理论基础：朗伯-比尔定律,相同条件下 测定不

14、同浓度标准溶液的吸光度A Ac 作图,2020/7/16,43,3、对朗伯-比尔定律的偏移,2020/7/16,44,a 非单色光引起的偏移,复合光由l1和l2组成，对于浓度不同的溶液a和b,引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。,2020/7/16,45,非均匀介质 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增加，导致线性关系上弯,b 物理化学因素,离解、缔合、异构等 如：Cr2O72-+H2O=2HCrO4-=2H+2CrO42-,化学反应,2020/7/16,46,吸光度标尺刻度不均匀,3、 吸光度测量的误差,dc/c= dA/A=dT/T

15、lnT,Er=dc/c100= dA/A100=dT/TlnT100,2020/7/16,47,根据误差传递公式，可以推导出浓度测量的相对误差为,T = 0.368 = 36.8 %,A = 0.434,为了使测量误差 4%，控制溶液的透光率,T = 65 15 %,当dT = 1%时,误差最小,A = 0.2 0.8,2020/7/16,48,控制吸光度范围的方法,1.改变比色皿的厚度 2.改变试液的浓度(称样量、稀释倍数等) 3.示差法,2020/7/16,49,例1:Fe(phen)32+溶液的 e =1.1104Lmol-1 cm-1, 在lmax处,用2cm比色皿测得溶液吸光度A=2

16、. 若DT=0.5%, 1)求Dc/c. 2)怎样才能使A=0.20.7?,2020/7/16,50,解:2) 溶液浓度不变,改变比色皿厚度: 选0.5cm比色皿,则A=0.5. 或比色皿厚度不变,改变溶液浓度: 稀释310倍. (称量减少到 m/3 m/10) A=0.70.2,2020/7/16,51,例2.若上题中比色皿厚度为0.5cm,欲使测量误差最小,溶液的浓度应为多少?,2020/7/16,52,1.目视比色法,用眼睛观察、比较溶液颜色的深浅以确定物质含量的方法。,标准系列法：,10.5 常用的吸光光度法,2020/7/16,53,简便，不需要仪器，也适于大批试样分析；灵敏度较高，

17、因为液层厚度大，所以适于微量组分测定；适用范围广，因为可在复合光下进行，有些显色反应不符合LambertBeers Law的也可测定。（4）缺点： 色阶难配； 准确度较差，相对误差5%20%。,（3）方法特点,2020/7/16,54,2. 标准曲线法,选择显色反应 选择显色剂 优化显色反应条件 选择检测波长 选择合适的浓度 选择参比溶液 建立标准曲线,测量条件选择,2020/7/16,55,3. 标准比较法,2020/7/16,56,(1)方法及原理：若某试样中被测组分含量较高，则用 一含被测组分的标液代替空白作参比（调节T=100% ， A=0），测定试样的AX，并使 （1） （2） （3

18、） （仍为一直线）,4. 示差吸光光度法,2020/7/16,57,方法比较,常规法,以空白溶剂为参比,示差法,以浓度为 Cs 的标准溶液为参比,（Cx Cs）,适宜 高 浓度的测定,2020/7/16,58,(2)示差吸光光度法的误差 因为在示差法中，AC，所以仪器测量所造成的浓度误差应为C的百分之几，而C仅是绝对浓度的很小部分，所以使绝对浓度的测量准确度大大提高。 例： 即：C仅占CX的1/10。 若在适宜范围内读数，其误差为5%，则绝对浓度造成的测量相对误差仅0.5%。 示差法之所以能提高测定结果的准确度，实质上是充分地利用了仪器的灵敏度，扩大了读数标尺的结果。,2020/7/16,59

19、,方法,定量原理,相对误差,常规法,示差法, Tr Tx, I0 Is,有,结论：示差法提高了准确度,2020/7/16,60,例题,已知 dT = 0.01, 样品Tx = 2.00 %, 标准 Ts = 10.0 %,示差法,常规法误差,示差法误差,2020/7/16,61,示差法提高准确度的实质,常规法,Tx,落在测量误差较 大 的范围,示差法,Tr,Ts,Ts,落在测量误差较 小 的范围,结论：示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度,2020/7/16,62,目的： 解决浑浊样品光度分析 消除背景吸收的干扰 多组分同时检测 原理： A = Al1-Al2 = （l1- l2）b

20、c,5. 双波长吸光光度法,2020/7/16,63,Y 的存在不干扰 X 的测定,双波长吸光光度法可消除背景干扰及共存组分的干扰,2020/7/16,64,标准曲线法测单一组分,1.选择合适的显色反应和显色条件 2.绘出被测组分的 吸收光谱曲线(用标液) 3.在max下测一系列标准溶液的A值，绘制工作曲线A-c 4.与工作曲线相同的方法，测未知物AX ， 从工作曲线上查cX,6.8 吸光光度法的应用,2020/7/16,65,1、 测定弱酸和弱碱的离解常数,AHB和AB-分别为有机弱酸HB在强酸和强碱性时的吸光度，它们此时分别全部以HB或B-形式存在。,HB H+ + B-,pKa=pH+

21、lg,HB,B-,A=AHB+AB-,对pH作图即可求得pKa,2020/7/16,66,以一元弱酸HA为例：,测定过程如下：,首先配制一系列总浓度（c）相等，而pH不同的HA溶液，用酸度计测定各溶液的pH值。 在酸式（HA）或碱式（A-）有最大吸收的波长处，用1cm比色皿测定各溶液的吸光度A。则：,（1）,2020/7/16,67,在高酸度时，弱酸几乎全部以酸式形式存在，即cHA,测得的吸光度为AHA，则：,在低酸度时，弱酸几乎全部以碱式形式存在（即cA-，测得的吸光度为AA-，则：,（2）,（3）,将（2）（3）式代入（1）式，得：,整理得：,或,2020/7/16,68,也可用图解法求p

22、Ka值，如图。,2020/7/16,69,2、络合物组成确定,1、饱和法（摩尔比法）,（1）原理：络合反应中M被R所 饱和（或反之）（2）方法：配一系列CM一定，CR不同的溶液（并使CR/CM在0.110之间）；在MRn的max测A；作ACR/CM曲线（见右图）。（3）此法特点：简便、快捷，但仅适于离解度小，且只生成一种显色络合物的组成的测定。 （此法要求在 下，R无明显吸收）,2020/7/16,70,2、连续变化法（等摩尔系列法）,方法原理：（1）配制一系列溶液，并使CM+CR=C（固定不变），但改变CMCR（010100）；（2）在有色络合物的最大吸收波长处测A值；（3）作ACM/C（或CR/C）曲线（4）由两曲线外