实验一聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段

1、实验一(1) 聚合酶链式反应 (pcr)扩增dna片段 polymerase chain reaction,实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果与讨论 注意事项,实验目的 掌握pcr反应的原理及技术 实验原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称pcr技术，是一种体外扩增特异dna片段的技术； 利用pcr技术可在短时间内获得数百万个特异的dna序列的拷贝；,pcr技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到了广泛的应用。 pcr技术实际上是在模板dna、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于dna聚合酶的酶促合成反应。 pcr技术的特异

2、性取决于引物和模板dna结合的特异性。,原理 反应体系： 含有目的基因或序列的dna模板 一对脱氧寡核苷酸引物（primer） 热稳定的dna聚合酶（taq酶） 4种脱氧核苷三磷酸(dntp) buffer及mg 2+等,pcr技术的参数主要有7个： 模板 引物 聚合酶 dntps 反应buffer 二价离子 一价离子,反应过程： 变性：升高温度使模板dna变性、双链分开； 退火：再降低温度使引物与模板dna配对互补结合； 延伸：然后升温到聚合酶反应适宜的温度，此时在聚合酶催化下，从引物3-羟基端开始，与模板dna上的碱基配对逐个加上核苷酸，合成新的dna链。 循环：其后再按高温变性、低温退火

3、、适温合成三步反复循环，新合成的dna在下一循环中又作为模板使用，每循环一次，合成的目的序列扩增一倍,或者说，反应分为三步： 变性：在高温条件下，dna双链解离形成单链dna； 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链； 延伸： 在dna聚合酶、dntps和mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的dna链延伸反应。 以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性dna片段得到了大量复制，数量可达到106-107个拷贝。,镁离子浓度：mg2+离子浓度对pcr扩增效率影响很大，浓度过高可降低pcr扩增的特异性；浓度过低则

4、影响pcr扩增产量甚至使pcr扩增失败而不出扩增条带。,循环次数：当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于dna 浓度。一般而言25-30轮循环已经足够；循环次数过多,会使pcr 产物中非特异性产物大量增加。,在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。 平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平,m marker 1-2 普通taq酶 3-4 hotstart taq酶,三、实验仪器、材料与试剂 （一）仪器 1. pcr仪 2. 台式离心机 3. 微量取液器 4. 紫外荧光观测仪 5. 高压灭菌的

5、微量离心管 6. dna扩增系统 7. 琼脂糖凝胶电泳系统,（二）材料 模板dna : 500bp的片段插入在pmd18-t 载体 （三）试剂 2 pcr mix （tiangen天根） m13f， m13r,pmd18-t vector,四、实验步骤 1. 总体系（20l）： ddh2o 7.5l6 m13f（通用引物） 0.75l6 m13r（通用引物） 0.75 l6 模板 1l6 2 mix(含dntp、taq酶、buffer等) 10l 6 注：做一管阴性对照，即模板为灭菌的双蒸水,m13f（通用引物）: gag cgg ata aca att tca cac agg m13r（通用

6、引物）: cgc cag ggt ttt ccc agt cac gac,附. 其他实验步骤 在0.2ml eppendorf管内配制25l反应体系： ddh2o： 18.25l (25-6.75) 7 10pcr buffer： 2.5l7 dntps（2.5mm4） 2l 7 m13-f(10m)： 0.5l 7 m13-r(10m)： 0.5l 7 taq 酶： 0.25ul 7 模板： 1l /每管 注：做一管阴性对照，即模板为灭菌的双蒸水,2. pcr程序 943min； 94 30s，55 30s，72 1min， 30 cycles； 72 7min； 16 ,电泳: 扩增结束后

7、，取大约30l- 50l pcr扩增产物进行1%的琼脂糖电泳，检测扩增情况、分析结果。 紫外灯下切割扩增的琼脂糖胶块中的 dna片段、放入eppendorf管中。 4冰箱存放，用于回收。,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 m,使用3 mg的dna marker dl2,000（500 ng/条带）进行1%的琼脂糖凝胶电泳后，各dna条带自上至下分别为2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp。,dl2000 1-1 1-2 2-1 2-2 3-1 3-2 4-1 4-2,2000bp,100bp,1. 2639m基因大小：813bp 2. 4635

8、m基因大小：945bp 3. 9041m基因大小：753bp 4. 大约500bp,五、实验结果与讨论 pcr体系的调制过程中应尽量减少污染的机会，以免出现目的条带以外的杂带。 如退火温度过低，也可能出现杂带。,六、注意事项 pcr反应是在一个在没有dna污染的干净环境中进行。 一般而言，只要能够得到可靠的结果，模板纯化的方法越简单越好。 要使用新配制的或适当贮存的未使用过的试剂或缓冲液来提取核酸，不要使用以前用于别的样品的试剂。 所用的所有溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染。配制试剂，操作样品，建立反应和以后的检测扩增产物过程中最好都使用手套。 所有pcr试剂中使用的水都应该用新鲜蒸馏的去离子

9、水，高压灭菌后分装备用。,所有试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成小份以确保实验间的连续性。 所有试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和离心管，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。 pcr样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。 扩增反应应当设计不加模板的阴性对照，电泳时应当加标准dna分子量标记（marker）以估计产物的大小。,附：引物设计原则 寡核苷酸引物长度一般为1530bp； g+c含量 g+c含量一般在40%-60%； 碱基的随机分布： 引物中碱基的分布最好是随机分布的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在； 引物自身：引物自身不应存在互补序列，否则引物自身折叠成发夹结构或引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。,引物之间： 两引物之间不应有互补性，尤其避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。 引物的3端： 引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。 引物的5端：引物的5端限定着pcr产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。 引物5端的修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光等；引入蛋白质结合位点；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入启动子序列等。,密码子的简并： 如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第三位，因为第三位容易发生简并，