淀粉酶紫外育种.ppt

1、实验二 淀粉酶产生菌紫外线诱变育种,1、掌握紫外线诱变育种的原理和方法步骤 2、了解淀粉酶活力测定方法,实验目的要求,实 验 原 理,实 验 步 骤,分三阶段进行:,诱变处理,观察诱变效应、接种、培养, -淀粉酶活力测定,第一部分 诱变处理,1） 制备菌（芽孢）悬液； 2） 显微镜直接计数，调整细胞（芽孢）浓度至约108/ml/； 3） 倒平板（牛肉膏蛋白胨；每组12套）； 4） 紫外线处理（3ml，直径6cm平皿，15min）； 5） 稀释（至105）；,实验步骤 (continued),实验步骤 (continued),6) 涂平板（取后3个稀释度，每稀释度2皿，每皿加菌液100ul）；

2、注意： 4）6）在暗室红灯下进行,7) 培养：平板倒置装于遮光袋，放置于37培养48小时；,8) 采用5）6）步同样方法稀释未经照射的菌液，并涂平板（6个），37培养48小时。,两天后进行第二阶段工作,实验步骤 (continued),第二部分： 观察诱变效应、接种、摇瓶培养,11）接种、培养： 选取诱变组透明圈直径和菌落直径比值较大的菌落（菌株）3个，分别接种牛肉膏蛋白胨液体培养基（每株接1瓶），37，160rpm，培养23天。,9）分别计数诱变组和对照组平板上菌落数，并计算致死率；,10）观察诱变效应： 加入碘液，分别测量诱变组和对照组1020个菌落的透明圈直径和菌落直径，并计算比值，求平

3、均数；将诱变组和对照组数据作比较。,实验步骤 (continued),第三部分 -淀粉酶活力测定（部颁标准）,1、原理 -淀粉酶能将淀粉分子键的-1，4葡萄糖苷键任意切断成长短不一的短链糊精，以及少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色特异反应逐渐消失，以该颜色消失的速度计算酶的活力。,实验步骤 (continued),2、试剂 1、原碘液 称取碘5.5g，碘化钾11g，先用少量蒸馏水使碘完全溶解后定容至250ml，贮存于棕色瓶中。 2、稀碘液 取原碘液1ml，加入碘化钾10g，用蒸馏水溶解定容至225ml，贮于棕色瓶中。 3、2%可溶性淀粉 精确称取2g可溶性淀粉（以绝干计），然后用少量蒸馏

4、水调匀，徐徐倾于煮沸的蒸馏水中，加热煮沸至透明为止，冷却定容至100ml。（注意：此溶液需当天配置）,实验步骤 (continued),4、0.02mol/L pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4H2O）4.52g和柠檬酸(C6H8O7H2O)0.807g,用蒸馏水溶解定容至100ml，配好后应以酸度计或精密试纸校正pH。 5、标准终点色溶液 A液：精确称取氯化钴（CoCl6H2O）4.02439g和重铬酸钾（K2Cr2O7）0.04878g，以蒸馏水定容至50ml。 B液：精确称取铬黑T（C20H12N2NaO7S）5mg,以蒸馏水溶解定容至50ml 使用时取A

5、液40ml于B液50ml混合。此混合液宜冰箱保存，使用15天后需要重新配制。,实验步骤 (continued),3、操作步骤,1) 发酵液经5000rpm离心10min，取上清，作为供试酶液。 2) 测定： A) 取2ml标准终点色溶液滴于白瓷板空穴内，作为比较颜色的标准。,B）取10ml 2%可溶性淀粉和10ml pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，放于大试管中，在60恒温水浴中预热45min。然后加入酶液1ml，立即记录时间，充分摇匀。定时用滴管取反应液约0.5ml，滴于预先充满比色稀碘液(约1.5ml）的磁板空穴内，当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准终点色相同时，即为反应终点，并记录时间t (min)。,实验步骤 (continued),4、计算酶活 酶活用1ml酶液于60，pH6.0的条件下，1h液化可溶性淀粉的克数来表示g可溶性淀粉/mlh 酶活力单位= 60/t102%,实验步骤 (continued),实验结果, ,实验报告,1、实验原理、方法步骤、结果及分析 2、思考题 1） 为分离获得产蛋白酶的细菌，应从何种环境取样？ 2）如要分离淀粉酶产生菌，应如何设计培养基？怎样识别目标菌？从何种环境取样？,准 备：,（配方见第三部分） 1）原碘液、稀碘液 （616-L1 & 616-R1） 2）2%可溶性淀粉 (