上课 血红蛋白的提取和分离

1、1.交流PPT，蛋白质分离原理：可以根据分子的形状和大小、电荷的性质和数量、溶解度、吸附特性、对其他分子的亲和力等蛋白质的不同特性，用于分离不同种类的蛋白质。1，基础知识，2，学习交流PPT，凝胶色谱法(分配色谱法)，1，概念：根据分离物质(如蛋白质)的相对分子质量，利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用进行分离。性质：小孔球的本质：多糖化合物示例：葡聚糖，琼脂糖，3，学习交流PPT，4，学习交流PPT，凝胶色谱分离蛋白，5，学习交流PPT，6，学习交流PPT，2，凝胶色谱法调整缓冲剂的使用比例，可以制作在其他PH范围内使用的缓冲液。8，学习交流PPT，(2)缓冲液，3，本作业使用的缓冲液为磷

2、酸缓冲液，成分：NaH2PO4 /Na2HPO4，9，学习交流PPT，(3)电泳：10，学习交流PPT在电场的作用下，这些带电分子向与电荷相反的电极移动。电泳在要分离的样品中，由于各种分子带电性质的差异和分子本身的大小、形状不同，带电分子可以徐璐制造不同的迁移速度，从而将各种分子从样品中分离出来。11，学习交流PPT，3，类型：琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯凝胶电泳。12，AC PPT，聚丙烯凝胶电泳是12烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯凝胶电泳，常用于测定蛋白质分子量。聚丙烯凝胶是单体丙烯酰胺和交联剂N，N-甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合而成的具有三维网状结构的凝胶。N，N-甲基双丙烯酰胺(交

3、联形成)，丙烯酰胺和交联剂N，N-甲基双丙烯酰胺的交联共聚，学习13，AC PPT，在聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质迁移率取决于它拥有的纯电荷数量和分子大小等。14，学习交流PPT，SDS能完全变性蛋白质。由多肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下分解成单肽链，因此测量结果只是单肽链的分子量。SDS可以形成多种蛋白质和蛋白质SDS复合物，SDS远远超过蛋白质分子的原始电荷。因此，不同蛋白质之间的电荷差异被掩盖，电泳迁移率完全取决于分子的大小。SDS官能团3360，15，学习交流PPT，实验操作程序，1，样品处理2，粗分离3，纯化4，纯度鉴定，16，学习交流PPT，血液成分？17，学习PPT交换，每个钚

4、链可以携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白含有血红蛋白，呈红色。血红蛋白的特征：18，交流PPT，1，红细胞的洗涤2，血红蛋白的释放3，分离血红蛋白溶液4，透析，(1)样品处理，19，交流PPT，问题：1，刚才采集的血液该怎么办？加入抗凝剂，防止血液凝固。怎么洗？取样分离吸吮逆红加液3次低速短时间离心生理盐水，1，红细胞的洗涤，20，交流PPT，3，洗涤的目的是什么？去除杂蛋白，有利于后续血红蛋白的分离纯化。洗涤干净的标志是什么？表示红细胞已经洗干净，直到上清液不再呈黄色。1，红细胞的洗涤，21，学习交流PPT，2，血红蛋白的释放，问：蒸馏水和甲苯的作用是什么？破裂红细胞释放血红蛋白。，22

5、，交流PPT，有机溶剂(无色透明甲苯层)地质物质(白色脂溶性物质沉淀层)血红蛋白溶液(红色透明液)红细胞粉碎物沉淀(暗红色沉淀物)，3，分离血红蛋白溶液，高速离心滤纸过滤器漏斗液，23透析目的：去除样品中分子量低的杂质。25，学习交流PPT，26，学习交流PPT，2。凝胶色谱操作：(1)凝胶色谱热制作：27，学习交流PPT，(2)凝胶色谱填充，凝胶选择：A B，意思：“G”表示凝胶的交叉程度、膨胀程度和分离范围。75表示凝胶的得数值，即每次凝胶膨胀时吸收7.5克。凝胶的预处理：计算了一定量的凝胶浸泡在蒸馏水或洗涤剂液中，充分溶解后配制凝胶悬浮液。28，交流PPT，凝胶光谱柱的充电方法：A，固定

6、：将光谱柱装置固定在支架上。b，充电：一次慢慢地将凝胶悬浮液倒入色谱柱，充电时轻拍色谱柱，使凝胶均匀填充。注：1，凝胶填充时尽量紧密，减少凝胶颗粒之间的间距。2.填充凝胶柱的时候泡沫存在，就会渡边杏存在。因为泡沫扰乱了洗涤剂中蛋白质的溶出顺序，降低了分离效果。(2)凝胶色谱柱的填充，29，交流PPT，洗涤平衡：1，注意液面不低于凝胶表面。否则，气泡混合，液体会影响柱内流动和最终生物高分子材料的分离效果。2、发生洗脱油类干燥时渡边杏，不能发生凝胶颗粒暴露的现象。50厘米高，(2)凝胶光谱柱的充电，30，学习交流PPT，(3)添加样品并洗脱，调节缓冲液：打开底部出口，使柱内缓冲液慢慢下降到与凝胶面

7、相同的水平，关闭出口。透析样品：吸管将1ml样品添加到色谱柱的顶部，滴样品时，吸管喷嘴贴在管壁上，移动加形，注意不要损伤凝胶面。31，学AC PPT，正确的追加工作是1，不要碰凝胶面，破坏。2、贴纸加样品。3、让吸管喷嘴沿管壁移动。32，学习交流PPT，样品渗透凝胶床：添加样品后，打开底部出口将样品渗透到凝胶层，样品完全进入凝胶层后，关闭底部出口冲洗。小心地将pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液放在适当的高度，连接缓冲液洗涤剂瓶，打开底部出口洗涤。收集：红色蛋白质接近色谱柱底部时，用试管收集流出液，每5毫升收集试管继续收集。(在分离过程中，如果红色条带均匀移动，则意味着颜色光谱柱制作成功

8、。)，33，AC PPT，34，学习AC PPT，(3) SDS聚丙烯凝胶电泳(选择)，检查血红蛋白纯度。1 .目的：35，学习交流PPT，1。样品处理通过红细胞清洗、血红蛋白释放、离心等收集血红蛋白溶液。2.样品的粗糙分离通过透析去除分子量小的杂质摘要：你能描述血红蛋白分离的整个过程吗？36，学习交流PPT，你处理的血液样本离心后是否分层(参见课本图5-18)，如果分层不明确，可能是洗涤次数少，血浆蛋白去除失败的原因。此外，离心速度过高，时间过长，白细胞与淋巴细胞一起沉淀，没有纯红细胞，会影响后续血红蛋白的提取纯度。，三，结果分析和评价，一，你完成血液样本处理了吗？您能说明处理后样品发生了什么变化吗？37，学习交流PPT，2，你填充的凝胶色谱柱会产生气泡吗？你的色谱成功填充了吗？你是怎么判断的？因为凝胶是半透明的介质，所以可以在凝胶柱旁边放置垂直于凝胶柱的荧光灯，以确保凝胶均匀填充。您还可以添加蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖等大分子的有色物质，观察带状移动。如果丝带均匀、窄、平坦，则表明凝胶色谱柱性能良好。颜色栏上出现图案或泡沫的时候，要轻拍柱子以消除泡沫，不能去除的时候，要重新安装柱子。38，学习AC PPT，凝胶光谱柱成