原位PCR技术.ppt

1、原位PCR技术,沈轻珊 08中鉴（1） 0806503123,原位PCR是将PCR技术与原位杂交技术结合，从而在组织原位检测单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列。1985年建立起来,成为首推迄 今 为止 对 分子 生 物 学 形 响最 大 的技术。 原位PCR技术.扬PCR技术敏感性高可以很容易地检测到低拷贝量的病毒DNA以及几乎任何一种特定的核酸序列甚至于检出仅有一个拷贝的基因序列，避其必须先从样品中提出DNA, 结 果 与 形 态 特 征 脱 节 不 能进 行 细 胞 定性 及 细胞 内定 位之短。 扬 DNA分 子杂交技术则是 可 以 进 行 与组 织 学 特 征 相 关 的 核 酸

2、研 究，包括DNA的 细 胞 内 定 位 ，避敏感度有限 常需 至 少20个拷贝 量 的核 酸 序 列,基本原理,由于细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进PCR扩增时，各种成分（如如引物、DNA聚合酶、核苷酸等）均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，与原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大、或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数级扩增，扩增的产物就可以被原位杂交技术检测出来。,基本步骤,1、细胞固定： 细胞固定旨在保存细胞形态结构. 并非所有的固定剂都能成功的用干原位PC

3、R.已 经 有 应 用酒 精闭 酒 精 醋 酸 混 合液，以及14%多聚甲醛固定而 原位 扩增。但以实验的经验及报道更多人推崇10%中性 福 尔 马 林。经固定 的细 胞 ，其原 位 PCR产物常游离 于反 应物中, 反 映 了 这 些 固 定 剂 未 能 很 好 地 将 蛋 白 以及核 酸变性、交 联。相才 反 福 尔马 林 则 能 很 好 地 使蛋 白质 凝 聚 核 酸 交 联， 从 而 形 成 有 效 的 限 制PCR产 物 扩 散 的 网 络性 屏 障。固定 时间以 不超15小时为宜。,基本步骤,2、蛋 白酶 消 化： 用 醛 类 固定 剂 可 以 使 核 酸与蛋 白质 交 联 形 从

4、 网 络性 的 屏 障结 构 这 种 屏障虽 然 对 防 止 扩 增 产 物 扩 散 有 益 却 妨 碎 了PCR反 应中 的 主 要 试 剂 充 分 透 入， 与靶DNA接 触。 因而 使 用 醛 类 固 定剂 以 后，适当的蛋白酶有利于建立试 剂接触靶DNA的通道 以 及 充 分 暴露 靶DNA。由于蛋白酶消化同时可 以 破 坏 业 己形 成 的 核 酸 蛋 白质 阿络 结 构， 因而 过 量 的 消化 将使扩 增产物 容 易扩散 。常用 的蛋 白 酶 有: 胃蛋 白酶, 工 作 浓 度2mg/ml;蛋白酶K，工作浓度0.25 mg/ml。对于福尔马林固定 的细 胞 或 石蜡 切片， 消

5、化 时 间 以 室 温 下10到15分 钟 为宜.。 短 暂固 定 的 细 胞 或 经 酒精、丙 酮固定 的 细胞 ，不 用 蛋白酶 消化 也 有 成功 扩 增 的。,基本步骤,3、 原位 PCR扩增: 成 功 的原 位 扩 增 需要 下列条件: 扩 增 效率 要 足 够; 不 能 有 引物 错 配 或 引物错配或引物寡聚；PCR产 物 尽 可 能 多 的原 位 滞 留 （1）提高 扩 增 效 率：原位PCR过程中常以增 加 关 键 试剂 或 扩 增 液成 分 的 浓度 来提 高效率。 （2）降低引物错配和寡聚：目前使用的方法是在温度到足够高从而足以阻止引物的非特异性 结合 之 后 加入Taq

6、酶。新近 报道 的 SSBs法 也 是 一 种很 有 参 考 价值 的降低引物 寡聚 和 错配 的方 法 。 （3）引物 的选 择 就 扩 增 片 段 而 言。 所 采 用的 引物 其 产 物 的 长 度 不 可太 短 也 不 可 过 长，太 短 产 物 容 易扩散 月 过 长 则 护增 效率 受 影 响。就 引物 的 数 量而 言 可 用 瑞 对或 多 对 引 物 。 （4） 循 环周 期： 原位PCR的扩增 效 率 不 及液相PCR, 因而掀 环周期不宜太 少 ,否则 产物少, 信号 不 够。但 周 期 太 多， 产 物 易扩 散。 通常采用的循环周期为20到30个。可以采取2到3个循环步

7、骤。,基本步骤,4、产 物检 测： 直接和 间接 的 原位法 有着完全不 同的检查法。前者 采 用 放射 自显 影 免 疫组 化 或 荧光镜 检等 而 后 者 则需要 特异性 标 记 的探 针 进行原位杂交。,基本分类,根据在扩增反应中所用的三磷酸核苷原料或引物是否标记，原位PCR技术可分为直接法和间接法两大类。此外，还有反转录原位PCR技术等。 1，直接法原位PCR技术 直接 法 是 在进 行 原 位PCR扩增 之前， 把 同位 素 （不常 用） 或非 同位素（ 常 用） 标记的 核苷 如Dig-l1-dUTP及Biotin-l1-dUTP等或荧光素标 记 的 引物 加 入PCR反 应 液

8、中, 随着扩增 的进行 标记 的核普 直接掺 入 到PCR产物中， 然后用 放 射 自显 影， 免 疫 组 织 化 学 或 荧 光 检测 术进行DNA序 列 的检 出及 定 位。该 法步 骤 较少， 但需注意假阳性的出现。,基本分类,2、 间接法原位PCR技术 间接 法 是 先 进 行 细 胞 内 DNA 分子原位 扩增 ，然 后 结 合核 酸 分 子 原 位 杂 交 进 行DNA序列 检 出及 定位 的技 术 该 法 步 骤 相对 较 多 需 时长， 但结果可靠。 3、原位反转录PCR技术 原位反转录PCR是将原位反转录PCR技术应用到组织细胞标本中的一种新技术，与RT-PCR不同点在于：进

9、行原位反转录PCR反应之前，组织标本要先用DNA酶处理，以破坏组织的DNA酶，这样才能保证扩增的模板是从mRNA反转录合成cDNA，而不是细胞原有的DNA。其他步骤与液相原位反转录PCR相似。,应用,原位 PCR 技术是一种将 PCR 技术的高度敏感、 高效扩增的特点与分子杂交方法精细定位的特点紧 密结合在一起发展起来的分子分析技术。它在原位 检测低拷贝基因及基因低水平的表达方面有着其独 特的优越性。这一技术从建立以来就受到国外有关 研究领域许多学者的重视 ,近年来 ,国内亦有了少数 报道10 ,11 。目前原位 PCR 主要应用在三个领域 :外源基因检测 ,基因变异的鉴定和基因表达研究。 4

10、.1 外源基因检测 4.1.1 感染基因检测,应用,4.1.1 感染基因检测 许多疾病是由于细菌、真菌、病毒等感染而引起的。应用原位 PCR 对艾滋病毒 ( human immunodefi2ciency virus type 1 ,HIV) 进行研究 ,导致了许多重大发Zehbe 等应用原位自我再生式序列复制反应( 3SR) 技术对宫颈癌 Si Ha 细胞系中单拷贝人类乳头瘤病毒 ( Human papilloma virus , HPV ) 的游离基因进行了检测 。运用原位 PCR 和原位 R T2PCR 还研究了许多保存的组织样品和细胞系中的其它病毒感染和细菌感染 。包括乙肝病毒 ,丙肝

11、病毒 ,单纯疱疹病毒 ,麻疹病毒 ,脊髓前角灰质炎病毒和结核杆菌等 。,应用,4.1.2 人工转入基因的检测 随着分子生物学和基因工程的迅速发展 ,越来越多的人从事转基因研究 ,在动物，植物转基因方已有不少成功的例子 ,在转基因动物成功的基础上发展起来的人的基因治疗正显示着美好的发展前景 。 4.2基因变异的研究 生物体具有遗传和变异的特性 ,当机体内外环境改变时 ,有的基因会发生改变 ,随之也可能发生相应的功能改变 。原位 PCR 能用于基因突变 、基因重组和染色体易位等基因变异研究 。,应用,4.3 基因表达及定位研究 原位 RT2PCR 技术能够反转录 mRNA 到 cDNA ,然后原位扩增 cDNA 来检测 mRNA 的表达。它可用于检测固有内源性基因表达和导入的外源基因表达两方面。其定位水平从组织细胞水平逐渐发展到了亚细胞水平和染色体上。,总结,原位 PCR 正经历着一个不断发展和完善的过程 ,在动物及人类研究中发展较快 ,成为