动物细胞融合.ppt

1、实验11、动物细胞融合（cell fusion）,一、概念,细胞融合（cell fusion） 是在自然条件或者人工诱导下，两个或者多个细胞合并成为双核或者多核细胞的过程，产生的细胞称为融合细胞。人工细胞融合是60年代发展起来的细胞工程技术，是在细胞水平上改造生物遗传性的方法。 基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。,二、细胞融合的应用,动物和植物的不同种、属之间的细胞可以融合，并且动植物之间的细胞可以融合，从而培养成各种性状的杂种细胞。细胞融合被广泛应用于研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克

2、隆抗体、研究肿瘤发生机制等领域。,三、人工诱导细胞融合,病毒诱导融合 化学诱导融合 电激诱导融合,1、病毒诱导融合,很多种类的病毒能介导细胞融合，如疱疹病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒、仙台病毒等。 这类病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。 融合率较高，对各种动物细胞都适宜。但是病毒不稳定，在保存过程中融合活性会降低，并且制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。,2、化学诱导融合,很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇（PEG）、二甲亚砜、山梨醇、甘

3、油、溶血性卵磷脂、磷酸酰丝氨酸等。 这类物质导致细胞膜脂分子排列的改变，在去除作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中由于接口处双分子层质膜的相互亲合和表面张力，使相接触的细胞发生融合。 使用方便，诱导细胞融合的频率比较高，效果稳定，适用于动植物，但是具有毒性。,3、电激诱导融合,发展于20世纪80年代，包括电激、激光诱导细胞融合方法。 使细胞在电场中极化，沿电力线排布，利用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜导致细胞融合。 具有融合过程容易控制、融合频率高、无毒性、作用机制明确、可重复性好等优点。,一、实验目的,学习使用化学法和电激法诱导细胞融合，并观察融合过程中细胞的行为和变化。,二

4、、实验原理（略）,三、实验材料、设备,鸡血红细胞悬液、GKN溶液、0.85生理盐水、50PEG溶液、0.6M蔗糖溶液 光学显微镜、离心机、恒温水浴锅、载玻片、盖玻片、离心管、吸管等 GKN溶液: 8gNaCl+0.4g KCL+1.77g NaH2PO4.2H2O + 0.69g Na2HPO4.12H2O+2g葡萄糖+0.01g酚红，加水至1000ml,操作步骤,PEG 融合 鸡红血球的洗涤： 取用0.9%生理盐水稀释100倍的鸡血1ml，以1000r/min离心4min，去上清；再依次用1ml生理盐水和1ml GKN溶液各洗一遍（洗涤离心）。 PEG(含5mM CaCl2)温育： 加GKN

5、溶液0.2ml悬浮细胞,再加入预热的50PEG 0.4ml，吹打均匀,于3537水浴锅中温育20min。 洗涤细胞：加GKN溶液0.6ml稀释,以1000r/min离心4min ，用0.5ml GKN溶液重悬细胞 观察：滴片（上盖玻片），显微镜观察，画图。,电融合 鸡红血球的洗涤： 取1%新鲜鸡血1ml于EP管中，1000r/min离心4min，去上清；在不打散细胞的情况下，用1ml 0.6M的蔗糖溶液轻洗细胞团两遍； 加8PEG 0.8ml，混匀，用10ml注射器上样电极板。 交流电场作用：成串脉冲频率：1-1.3M Hz，成串脉冲电压：10-20 V。 直流脉冲击穿：200-250 V，0

6、.1ms（脉宽）； 用0.1ml生理盐水冲洗收集细胞，滴片。观察：画图。,PEG 融合,鸡红血球的洗涤： 每组取用0.9%生理盐水稀释100倍的鸡血2ml分装于2支Ep管中，以1000r/min离心4min，去上清；再依次用1ml生理盐水和1ml GKN溶液各洗一遍（洗涤离心），各加0.2mlGKN悬浮细胞。 HeLa细胞的收集： 弃去培养基， 1ml 生理盐水漂洗细胞2次，0.5ml胰酶消化细胞3分钟，2ml培养基终止消化，吹打皿底将细胞洗脱下来，分装于2支Ep管中， 1000r/min离心5min ，弃上清，各加0.2mlGKN悬浮细胞。 PEG(含5mM CaCl2)温育： 分别取0.1ml鸡血细胞和0.1ml HeLa细胞于1.5ml Ep管中,混匀，再加入预热的50PEG 0.4ml，吹打