ACCESS免疫化学发光技术介绍

1、ACCESS化学发光系统,免疫分析系统 Access家族系列的创新史,免疫全系列产品,Access 2,UniCel DxI 600,UniCel DxI 800,UniCel DxC 600i,分析项目,UniCel DxC 660i UniCel DxC 880i UniCel DxC 680i UniCel DxC 860i,一种技术的延续和相同的试剂盒在不同 分析平台的使用，确保病人结果的一致性,免疫分析检测的浓度关系,临床生化,10,-12,10,-9,10,-6,10,-3,10,-0,pg/mL,ng/mL,mg/mL,mg/mL,gm/mL,免疫分析,治疗药物,甲状腺激素,性激

2、素,特殊过敏原,肿瘤标志物,感染性疾病,维他命,心脏标志物,丰富的分析菜单,性激素（12） 雌二醇 促卵泡生成激素 泌乳素 促黄体生成激素 游离雌三醇 总人绒毛膜促性腺激素 孕酮 睾酮 硫酸脱氢表雄酮 抑制素A 性激素结合球蛋白 PAPP-A * 唐氏筛查 甲状腺（9） 第三代促甲状腺素 三碘甲状腺原氨酸 游离三碘甲状腺素原氨酸 甲状腺素 游离甲状腺素 甲状腺过氧化物酶抗体 抗甲状腺球蛋白抗体 甲状腺球蛋白 甲状腺摄取,肿瘤标志物（8） 甲胎蛋白 癌胚抗原 BR(CA15-3) OV(CA12-5) GI(CA19-9) 前列腺特异性抗原 游离前列腺特异性抗原 ISOFORMS PSA *,贫

3、血类（7） 维生素B12 铁蛋白 叶酸 红细胞叶酸 内因子抗体 促红细胞生成素 可溶性转铁蛋白受体 心血管（4） 肌酸激酶同功酶-Mass 肌红蛋白 肌钙蛋白 BNP,骨代谢类（2） 全段甲状旁腺激素 骨碱性磷酸酶 过敏原 总IgE 生长类 人类生长激素 糖尿病类 胰岛素 肾上腺/垂体 皮质醇 炎症指标 白介素-6 自身免疫 ANA *,* 研发中,免疫分析的基本概念,免疫分析的基本原理,免疫分析是根据抗体与特异性的抗原结合的原理进行定性/定量检测的技术。,“锁和钥匙”,免疫分析检测的发展历程免疫学方法的发展,非标记免疫 标记免疫,标记免疫技术,将Ag或Ab用标记物(如荧光素、酶、放射性同位素

4、、化学发光物质等)进行标记，在与标本中的相应Ab或Ag反应后，可以不必测定Ag-Ab复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。,标记免疫分析技术三要素,通常在检测系统中会使用到一种叫标记物（labeling）的物质,常标记在抗体上 通常会有一个分离（separation）的过程在最后读取信号前 需要去仔细关注一下分析的模式（format）,免疫分析的经典定义,免疫分析 是一种通过特异性的抗体与分析物的结合来检测或者定量抗体或抗原的一种分析技术,IgG 抗体,两条重链和两条轻链 分子大小 150,000 道尔顿,免疫分析的工作定义,免疫分析 是利用特

5、异性的抗体与底物结合、但不能用简单的化学方法读数和检测的一种分析方法 需要通过特异性抗体的标记形成测试系统 通常需要在分析检测前进行分离（异相免疫技术） 特别注意分析的形式,免疫分析的类型,均相免疫技术 无需分离步骤 容易自动化, 但不够灵活，具有局限性 比浊法 适合含量较高的大分子物质 FPIA, EMIT, CEDIA 主要针对小分子分析物,特别是药物检测 FPIA:荧光偏振免疫分析 EMIT:多聚酶免疫分析技术 CEDIA:克隆酶供体免疫分析,免疫分析的类型,异相免疫分析技术 需要分离步骤 不容易自动化, 但适合多种分析方法和检测手段，较容易灵活控制 高度敏感性和特异性 反应时间短,免疫

6、分析的类型,免疫分析 - “what” 检测手段 化学发光 分离技术 磁性微粒子 结合方式 灵活多变（竞争法、夹心法）,- “how”,检测技术,免疫分析 检测技术 方法多样 需要有一种 “标记物” 来生成可供检测的能量 标记物可能需要或不需要活化 需要有适合由该标记物生成的可检测物的侦测器（光电倍增管） 分离技术 结合方式,标记免疫分析技术,放射免疫分析 酶免疫分析 荧光免疫分析 化学发光免疫分析,标记免疫分析技术,放射免疫分析- RIA 不稳定的分子衰减过程中释放出射线 125I 产生 射线发射器 通过记数仪进行检测 3H 产生射线 通过液体闪烁记数仪进行检测,放射免疫分析技术,优点 敏感

7、性高 动力学范围宽 干扰因素少 局限性 有害的底物 不易自动化 射线半衰期短 射线存在废物处理问题,标记免疫技术,荧光免疫分析技术 - FIA 原理 荧光底物, 通常使用 4-MUP(4-甲基伞酮) 吸收并储存能量，进入激发态，并回复到基态的过程中，多余的能量以电磁辐射的形式（发光）释放 通过荧光计检测 优点 跟RIA具有相同的敏感性和动力学检测范围 避免了RIA的半衰期短、有害物质的环境污染问题 局限性 容易受自动荧光素或者样本中含有的能使荧光淬灭的物质干扰 应用举例 Abbott - Large molecule (MEIA) assays on IMx, AxSYM,标记免疫技术,荧光偏

8、振免疫技术 - FPIA 原理 单束偏振光通过反应物 通过检测偏振荧光的强度来测量所检测的物质，多采用竞争抑制法 优点 属于均相免疫分析技术，无需分离步骤 局限性 只用于小分子分析物，采取竞争法 应用举例 Abbott - Small molecule assays on TDx, IMx, AxSYM,标记免疫技术,酶免疫技术 - EIA 原理 在基本的免疫学反应完成后，加入底物催化反应 通常这种反应包含有颜色变化，并且可以通过分光光度计检测 优点 技术容易应用，经常用来做定性检测 局限性 做定量检测的时候，灵敏度差、检测范围不够宽,标记免疫技术,化学发光免疫分析技术 - CLEIA 原理

9、是一种不稳定的中间体 利用化学反应释放的自由能激发中间体（底物AMPPD） 当其从激发态回到基态，同时释放出等能级的光子，即引起发光 具有荧光一样的特异性，但又无需激发光 优点 具有放射免疫的所有优点（如灵敏度高：ACCESS达10-21 mol/L 、动力学范围宽等），同时又避免了放射免疫的缺点 通过简单的光度计就可以进行读数 同时由于无需激发光，可以避免杂散光的干扰，本底特别低 类型 闪烁，发光 (包括 “增强”),标记免疫技术的发展历程,荧光素(Fluorophores) FIA 放射性同位素(Radioisotopes) RIA 酶(Enzymes) EIA 化学发光物质 - CLIA

10、,化学发光免疫技术,化学发光物质 - CLIA 原理 某些 化合物（发光底物）可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子升至电子激发态。当此产物分子或中间态分子衰退回基态时，以发射光子的形式释放能量。） 优势 - 具备RIA所拥有的优势(灵敏度和宽线性),但排除其缺点 用一个简单的光度计读数 非常低的背景干扰 类型 - 闪烁(flash), 连续(glow) 发光(包含 “增强发光”),化学发光物质,AMPPD, Dioxetane (Lumi-Phos 530TM) 代表性分析系统 BCI - Access/Access 2 /DxI800 DPC - Immulite/Im

11、mulite 2000 Fujirebio - Lumipulse 1200,ACCESS使用的发光底物AMPPD 目前性能最好的化学发光底物,4-甲氧基-4-（3-苯磷酸盐）螺-（1，2-二螺4，4二氧己烷-3，2-金刚烷 4-methoxy-4-(3-phosphatephenyl)-spiro-(1,2-dioxetane)-3,2adamantane AMPPD是一种金刚基二螺4，4二氧己烷的磷酸酯。经ALP水解生成一种不稳定的阴离子，该阴离子分解时持续发光。发光强度稳定，与ALP成正比。,ACCESS Dioxetane 化学发光物质,Alkaline Phosphatase,发光底

12、物在碱性磷酸酶作用下磷酸酯基发生水解，脱去一个磷酸基而得到一个中等稳定的中间体AMPD-，(半衰期230分钟)。此中间体分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当其回到基态时产生470nm的光，并可持续几十分钟。,ACCESS Dioxetane化学发光物质,稳定持续的发光,分离技术,标记免疫分析 检测技术 分离技术(Separation) 有很多方式 典型的是,特异性结合的分析物被保留而未结合物质和无用的反应物被清除 分析模式,ACCESS磁颗粒分离技术,磁性微粒子技术的优点： 快速分离结合相与游离相 提高与Ag或Ab包被亲和力 提高接触表面积/反应容量

13、比例，实现微量分析 不需要抗体分离步骤，杜绝干扰与交叉反应 允许共价耦合反应，因此可以检测大/小分子的各种物质成分 能应用各种分析设计与反应模式，扩大应用范围 如：夹心法，竟争法，抗体检测法等 利于检测自动化与微量分析,分析模式,标记免疫分析 检测技术 分离技术 分析模式- 有很多种方式 可定义为分析的 “处方” 设定一个最优化的模式(可变量)去最大化项目的临床应用,Access 的分析模式,基本分析模式 夹心法(Sandwich) 抗原或抗体的检测 竞争结合(Competitive binding) 试剂的加入 同步(Simultaneous) (1步, 1次清洗) 分步(Sequentia

14、l) (2步, 2次清洗) “Piggyback” (2步, 1次清洗),bhCG (1 步,夹心法),+,+,清洗去除未结合物质,底物加入,发光,+,+,钩状效应（Hook Effect）,Y,清洗步骤,Y,Y,Y,37 C,Y,Y,Dioxitane-PO4,37 C,钩状效应（Hook Effect）,Dioxitane,2步,夹心法抗体检测,+,+,2步,夹心法抗体检测,Dioxitane-PO4,夹心法的定标曲线,6 个逐渐增加的不同浓度水平的标准品 信号与浓度呈正比关系,夹心法分析模式,捕捉抗体(Capture antibody)和标记抗体(labeled antibody) 每个

15、抗体的存在可以与更多的分析物发生反应 分析更可靠,精确,准确和可重现性 分析更灵敏因为所有分析物都参与反应,夹心法分析模式,捕捉抗体(Capture antibody)和标记抗体(labeled antibody) 每个抗体的不同可以针对不同的抗原决定簇，或二个在同一个抗原决定簇 分析更特异因为二个抗体同时反应 受限制于检测大分子物质,bhCG hTSHIgEProlactin hFSH hLHFerritinChlamydia,+,+,1步,竞争法,+,清洗步骤,1步,竞争法,Dioxitane-PO4,Dioxetane,竞争法的标准曲线,6 个逐渐增加的不同浓度水平的标准品 信号与浓度呈

16、反比关系,竞争法分析模式,只有捕捉抗体 主要针对小分子物质检测 没有足够表面积的分析物去符合 “夹心法” 要求,T3FT3 B12 Digoxin Progesterone T4 FT4 Folate Cortisol Estradiol,Access 分析步骤,Access 工作流程,分析模块,Supplies tracked automatically Reaction vessels (RVs) Reaction vessel waste bag 3 hour walkaway time,分析模块,Wash arm 3 dispense probes 3 aspirate probes

17、Substrate probe Wash carousel Moves RVs through wash process, substrate incubation and signal reading Contains magnets Supports mixer belt Attached to luminometer Reads RLUs (Relative Light Units) of each RV,Substrate probe,Aspirate probes,Dispense probes,液路模块,Supplies tracked automatically Substrat

18、e Wash buffer Liquid waste 3 hour walkaway time,液路模块,Fluids tray Supplies bulk fluids Stores liquid waste,Liquid waste bottle,Waste exhaust filter,Substrate bottle,Buffer bottle,Buffer reservoir,Weight sensor,Float sensor,电子模块,Hard disc drive,Reset button,Floppy drive,Card cage,Power supply,Chassis

19、Base Module,Top cover,Front panel,Carousel door,Supply cover,Base panel,异嗜性抗体(Heterophile Antibody),病人样品中可能自然产生一些针对动物免疫球蛋白的抗体(通常是鼠或羊) 来源于暴露于这些动物或接受过动物血清的治疗 分析的干扰 可以在双单克隆夹心法分析模式中引起假阳性 可以在单克隆/多克隆分析模式中出现假阴性,异嗜性抗体,封闭剂可以加在反应基质中或整合在试剂盒内 鼠 (鼠科类), 鸟 (鸟科类) 和羊蛋白 各个厂家生产的分析试剂都有可能会不同程度的受到任何一个病人血清的影响！,试剂说明书的数据,期望

20、值(参考范围)研究 正常人群的分布? 非正态的分布? 分析系统的详细说明 每个实验室必须自己建立人群的正常值,Test Result FlagsFatal,SYS: system error that is known or likely to affect the sample result TMP: temperature out of range substrate, incubator, wash carousel QNS: quantity (of sample) not sufficient NCR: No calibration RLU: RLUs out of range of

21、 PMT, either 30,000,000 NRV: supplies insufficient Appears on screen during run Sample status reverts to Requested when the run is completed IND: indeterminate The RLU value is so low that it cannot be distinguished from a system failure Typically seen when a pack is not present On Access this flag is only applied to Digoxin UNR: the obtained RLUs are either unusually high or low for this sample The operator should investigat