实验五. 细胞染色体制备

1、了解组织培养细胞球染色体的制备、实验5、实验目的实验原理实验试剂和仪器实验程序注意事项、组织细胞的培养方法。 掌握染色体标本的制造方法。 一、实验目的、二、实验原理、二、实验原理、处于指数生长期的细胞球，经过短期培养后，用秋水仙碱处理，中期切断细胞分裂，经低渗透、固定、滴片和染色，可以得到大量的中期分裂相的细胞球，制作后可以清楚的材料：具有较强的生长分裂能力的细胞系(hela ) 白血病k562细胞球，c2c12 bhk细胞球等)仪器：恒温孵化机、离心机、显微镜培养瓶、移液器、载玻片试剂：培养液(rpmi1640，m199，dmem等)、胎牛血清、双抗、nahco3、生理盐溶液染色体可收缩为一

2、定的形式。 目的：获得大量中期分裂相细胞球。 2. carnoy固定液新配置的甲醇：冰冰乙酸混合液(3:1 )。 快速穿透细胞球，固定和维持染色体结构的完全性，增强染色体嗜盐化学基性，达到良好的染色效果，3 .低浸出液(0.075m/l kcl )低渗透的目的是通过反渗透作用使细胞球膨胀(但不破裂) 4 .染料(giemsa )不是单一的染料，而是天蓝、伊红、甘油和甲醇的混合物，调配后原液被储藏，染色后染色质呈红色，细胞核呈蓝色。4、实验步骤、培养液4ml胎牛血清1ml、培养24小时、培养液1ml中加入1ug继续培养3-5小时，培养、秋水仙碱、培养瓶、取样，将培养液1ml取入离心管10ml、1

3、 .中固定，加入3-4滴固定液，轻吹后，将上清离心7、8、9、空气干燥、giemsa染色10min、细水流洗净、染色、10 .11 .12 .、相反，在低渗透后，要小心，和善地混合细胞球， 必须防止胞质膜的破裂、染色体的散逸3 )离心前均衡，离心速度过高，细胞球块难以分解，相反细胞球容易丢失4 )决定在滴下载玻片清洁且必须予冷的片时向玻璃板滴下材料，5、注意事项、实验步骤、 1 .秋水仙碱预处理收集1ml生长旺盛的细胞球，轻轻吹走，加入秋水仙碱1ul，继续培养(完成)6-8小时。 2 .前处理后的细胞球，以1000rpm离心5min去上清3 .低渗透处理：加入1ml低渗透液，轻轻吹走，使细胞球

4、再悬浮，然后加入7ml低渗透液，在室温下静置20min，4 .预固定：加入固定液3-4滴后轻轻搅拌，避免粘连1000rpm离心5min 5.固定：沿着管壁慢慢加入3ml的固定液，2分钟后用吸引管轻轻吹走，使细胞球分散，10分钟后，以1000rpm离心5min，去上清6 .二次固定：加入3ml的固定液，均匀喷涂，固定10分钟后去上清中固定7.3次：重复步骤6、8、控制混悬剂：去除上清后残留0.5ml的固定液，用吸引管轻轻吹走制成细胞球混悬剂9、滴片：将冷的载玻片倾斜30度，吸取细胞球混悬剂后从载玻片至少离开1m滴到载玻片上空气干燥10 .染色：在干燥的载玻片上滴加giemsa，染色10分钟，细水洗净后空气干燥11 .镜检：低倍镜下寻找染色体分散良好、染色适度的分裂相，油镜下观察染色体形态，修正数。 小鼠中期细胞球染色体(2n=40 )、小鼠染色体核型分析、人慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia )、chr9和chr22相互易位，chr9上的c-abl oncogene和chr22上的其产物是融合蛋白融合蛋白，细胞球不受细胞周期控制如果一个细胞球含有这种易位chr，就会致病。猫叫综合征(cat cry syndrome