实验一微生物培养基的制备与灭菌

1、实验1微生物培养基的制备和灭菌(8格)一、目的要求1 .学习调制微生物培养基的一般方法和程序。2 .掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。二、基本原理正确掌握培养基的制备方法是从事微生物学实验的重要基础。 由于微生物的种类和代谢类型的多样性，培养微生物的培养基的种类也很多，虽然它们的配方和制备方法各不相同，但一般培养基的制备顺序大致相同。 例如器皿的准备、培养基的制备和分装、棉塞的制作、培养基的灭菌、斜面和平板的制作、培养基的无菌检查等基本环节几乎相同。三、实验材料1、药品：牛肉膏培养基、琼脂粉、1mol/l的naoh和1mol/l hcl溶液。2 .仪器和玻璃器具：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、洁净

2、台、酒精灯、移液器、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿和玻璃棒等。3、其他物品：药匙、称量纸、ph试验纸、马克笔、棉花、报纸、查询密码和注射器等。四、操作程序(1)玻璃制容器的清洗玻璃容器使用前要用洗衣粉清洗，用水冲洗，放入电烤箱干燥后准备。(二)牛肉糊蛋白胨培养基的制备1 .培养基的制备(1)称量：用培养基配方计算各成分的使用量，用电子天平正确称量后放入烧杯中。注意：称量药品时，请务必使用称量纸，而不要使用滤纸。 不要搅拌药用的药匙，说药品完成后必须马上盖上瓶盖。(2)溶解：用量筒称量必要体积的水(根据实验的需要使用自来水和蒸馏水)，放入烧杯中，用玻璃棒搅拌溶解即可。(3)调ph :一般用ph

3、试验纸测定培养基的ph，可以用1mol/l naoh或1mol/l hcl溶液调节。 调节ph值时，滴加naoh或hci溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中的成分。 一边搅拌，一边用ph试验纸进行试验，直到达到必要的ph。注意：不要过度调整ph值，以免召回影响培养基中各种络离子的浓度。2 .调制液体培养基(1)用量筒正确称量培养基20ml，装入三角瓶100ml，塞上棉塞，用报纸包住瓶口用棉线包住灭菌。注意：注入溶液时不要弄湿瓶口。 缠绷带的时候不要把瓶子打倒弄湿棉塞。3 .制备固体培养基(1)平板培养基a .用量筒正确称量培养基100ml，放入250ml三角瓶中，加入琼脂粉2g，装入棉塞，用

4、报纸包住瓶口用棉线包住灭菌。b .把洗净干燥的培养皿用报纸包起来灭菌。用c .超纯平台，将放入三角瓶灭菌后的琼脂培养基冷却至50左右，注入无菌培养皿。 温度过高的话皿盖的冷凝水过多。温度不足50的话培养基容易凝固，不能制作平板。 平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部，左手在云同步上用小拇指和手掌打开棉塞，烧瓶口，用左手大拇哥打开培养皿盖，用左手大拇哥将培养皿盖倾斜10-15ml，放置在桌子上，轻轻转动盘子，使培养基均匀分布在整个平皿上(2)坡面培养基a .用量筒称量培养基100ml，放入烧杯中，加入琼脂粉2g，在石棉网上加热，用玻璃棒搅拌，溶解至琼脂粉溶解。b .将洗净干燥的

5、试管放置在试管架子上，用注射器将溶解了琼脂粉的培养基注入试管高度的1/4。注意：不要弄脏试管的口。c .培养基冷却凝固后，塞上棉塞，将2或4根组成一组，用报纸包住试管口，灭菌。d .灭菌后，趁热将试管口端放在一根长木棒上，调整倾斜度，以便斜面长度不超过试管全长的1/2。10 .无菌检查灭菌后的培养基放入37的温箱培养2448h，可以无菌生长使用，或储藏在冰箱或清洁的橱柜中备用。(3)培养基灭菌培养基分注包扎后，立即在调制方法规定的灭菌条件下进行高压蒸汽灭菌。(4)培养基的灭菌检查灭菌后的培养基一般是无菌检查。 最好取出1-2管(瓶)，放入37的温箱中培养1-2天，确定无菌后再使用。五、实验内容

6、1 .必要时清洗各种玻璃容器，进行干燥和绷带。2 .根据需要调制微生物培养基。3 .掌握用高压蒸汽灭菌锅对培养基进行灭菌。4 .掌握液体培养基、平板培养基和斜面培养基的制备。六、实验报告1 .记录本实验制备的培养基的名称、数量，图解说明其制备过程，并指出要点。2 .记录制作培养基的无菌检查结果。七、实验思考题1 .为什么微生物实验室使用的三角瓶口或者试验管口能在要塞上安装棉塞使用？能换成木塞或者棉皮塞吗？2 .制备培养基时，为什么要调节ph值？3、高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌的要求温度低，时间短？4、高压蒸汽灭菌的原理是什么？ 如果压力修正的指针指向必要的压力，为什么能达到必要的灭菌温度？5、

7、培养基配制完毕后，为什么必须马上灭菌？ 不能及时灭菌的情况下是怎么破吗？ 灭菌后的培养基如何进行无菌检查？6 .请在设置修订实验中进行饮料的无菌检查。附录高压蒸汽灭菌技术一、目的要求了解消毒和灭菌的原理，掌握各种灭菌方法的操作步骤。二、实验材料上述制备的培养基、包裹培养皿、试管、高压蒸汽灭菌锅、注射器、大头针定径套、玻璃涂料棒。三、基本原理微生物实验需要纯培养，无杂菌污染，必须对使用的器材、培养基、工作场所进行灭菌消毒。 灭菌是指杀死某个环境的所有微生物(包括微生物的营养体、芽胞、孢子)。 实验室常用的灭菌方法包括直接灼烧、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、煮沸灭菌等方法。 这些个方法的

8、基本原理是加热使微生物体内的蛋白质凝固变性，达到灭菌的目的。四、操作程序将物品放入密封的高压蒸汽灭菌锅中，在一定的压力下保持15-30分钟进行灭菌。 该方法适用于培养基、无菌水、工作服装等物品的灭菌，也可用于玻璃容器的灭菌。将杀菌的东西放入密闭的加压杀菌锅中，通过加热使杀菌锅的茄克衫之间的水沸腾产生蒸汽。 水蒸气急剧地从排气阀排出锅内的冷气，关闭排气阀，继续加热的话，由于蒸气不溢出，灭菌锅内的压力增加，沸点变高，得到超过100的温度，菌体蛋白质凝固变性，达到灭菌的目的。在相同温度下，湿热灭菌的效果高于干热灭菌。 1 .湿热灭菌中菌体吸收水分，蛋白质容易凝固变性，蛋白质随着含水量的增加所需的凝固

9、温度降低2 .湿热灭菌中蒸汽的透过力大于干燥空气3 .蒸汽在被灭菌物体的表面凝结，放出大量的汽化潜热，可以迅速提高灭菌物体表面的温度，增加灭菌效果。实验室常用的灭菌锅有非自学便携式高压蒸汽灭菌锅和自学式灭菌锅，其结构和工作原理相同。 本实验介绍的是半自学高压蒸汽灭菌锅，自学式灭菌锅的使用可以参考制造商说明书。 具体的操作步骤如下1、加水：先取出内层锅，然后在外层锅中加入适量的水，使水面不加热蛇管，与三角架平整为好。 别忘了检查水位。 加水量太少的话，灭菌锅可能会烧坏，出岔子破裂。2、放入：放入内层锅中，放入要灭菌的东西。 注意不要过度堵塞，以免妨碍蒸汽流通，影响灭菌效果。 放置培养基的容器要注

10、意不要让液体溢出，三角瓶和试验管口端都不要接触桶壁，要把冷凝水包着的纸弄湿，以免进入棉塞。盖上盖子：将盖子和排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽中，校准锅盖，对准螺丝口，将对称相对的2根螺栓拧紧到云同步上，使螺栓松动一致，防止空气泄漏，打开排气阀。4、排气：打开电源加热灭菌锅，煮沸水，将锅内的冷空气和水蒸气一起从排气孔排出。 如果排出的空气流动强烈，发出嘘声的话，锅内的空气排出，沸腾后大约需要3分钟。5、升压：冷气完全排出后，关闭排气阀，继续加热，锅内的压力开始上升。6 .保压：压力修正指针达到所需压力时，控制电源，开始修正时，维持压力至所需时间。 如本实验所示，在0.1mpa、121.5下灭菌20分钟。 注意：因为灭菌的主要原因不是压力而是温度，所以锅内的冷气必须关闭排气阀，在维持必要的压力之前完全排出。7、降压：达到灭菌所需时间后，切断电源，自然降低灭菌锅的温度，压力