基因工程试卷2

1、 华中农业大学本科课程考试评分标准 考试课程与试卷类型：基因操作原理 姓 名： 学年学期： 学号： 考试时间： 班级： 一、填空题一、填空题（每小题 2 分，共 30 分） 1. PCR 技术应用广泛，以下不属于 PCR 应用的为 _D_：(A) 随机扩增多态性 DNA(RAPD)； (B) 扩增片段长度多态性(AFLP)； (C) RACE； (D) S1 酶作图。 2. 噬菌体线性 DNA 分子的两端各有一个_12_个碱基组成的天然黏性末端。 3. PCR 扩增有时会出现弥散的条带，以下原因阐述不正确的是_B_：(A) 退火温度 过低； (B) 退火温度过高； (C) dNTP 浓度过高；

2、 (D) 循环次数过多。 4. 下列哪一种酶作用时需要引物_B_： (A) 末端转移酶； (B) 反转录酶； (C) DNA 连接酶； (D) 限制酶。 5. Cosmid 实际上是由_ 噬菌体_和_质粒_构成的杂合载体， 也可以说是带有_cos_ 序列的质粒。 6. 限制性内切酶的命名主要根据_来源菌株属名第一个字母，种名头两个字母以及菌株号、 序号_来确定，以下各种书写方式中哪种或哪几种是正确的_AC_：(A) PstI; (B) KpnI； (C) HindIII; (D) HindIII; (E) Tth111I; (F) Bsp1286I； (G) XbaI 7. 在分子克隆常用的

3、E.coli 菌株中 Dam 和 Dcm 甲基化酶都是有活性的，它们可在 DNA 的特定位点作甲基化修饰。而许多限制性内切酶对甲基化是敏感的，一旦所识别的酶切 位点被甲基化就不能切割该位点，如 ClaI (AT/CGAT)。请问 ClaI 不能切割以下哪个或哪 些来自dam+ dcm+ E.coli菌株的DNA序列_C_。 (A) ATCGATA； (B) ATCGATG； (C) ATCGATC； (D) ATCGATT。 8. 限制性内切酶有其特定的识别位点，如 EcoRI 的识别位点为 _GAATTC_；有些限制 性内切酶切割 DNA 后可产生带有相同末端的 DNA 产物，这些酶称为同尾

4、酶，例如 _BamHI_限制性内切酶与_Sau3AI_限制性内切酶切割 DNA 形成的末端相 同。 （任举一例都可以） 9. 在基因操作过程中会使用一些多对人体有害的物质, 操作时应小心谨慎, 常用的有害物 质有 UV light、DEPC、_EB_和_苯酚_等。 （任举一例都可以） 10. 根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA 文库等。在下列文库中_C_是 cDNA 文库。(A) YAC 文库； (B) PAC 文库； (C) 扣减文库； (D) BAC 文库。 11. M13KO7 是一种辅助噬菌体，可用它帮助噬菌粒制备单链 DNA，这是因为以下原因_B_： (A) M13

5、KO7 能够进行滚环复制，得到大量的单链噬菌体 DNA； (B) M13KO7 能够提供 成熟包装的蛋白； (C) M13KO7 提供了成熟包装所需的信号； (D) M13KO7 的 10 个基 因都是正常的。 12. 在制作 DNA 嵌套缺失突变体时主要有 3 种方法，其核心技术都使用了一种核酸酶，它们 分别是_外切核酸酶 III_、_BAL31_和_DNaseI_。 13. 在核酸杂交过程中，一般都要先做预杂交，这是为了_B_：(A) 做预备试验，寻找最佳 反应条件； (B) 封闭背景； (C) 使杂交信号更强； (D) 减少非特异性杂交信号。 14. 在许多克隆载体中都使用了-互补机制来

6、做筛选标记， 也就是俗称的“蓝白菌落”筛选， 在 应用过程中使用了两种引起颜色变化的试剂，它们是_x-gal_和_IPTG_。 15. 在基因操作中有些不同的名称具有相同的缩写， 例如RT-PCR, 可以是_实时定量PCR_ 或_反转录 PCR_的缩写。 二、名词解释名词解释（每小题 3 分，共 21 分） 1 Star Activity (in restriction enzymes) 星星活性， （1） 极端非标准条件下，限制性内切酶切割与识别序列相似的序列，这个改变的俄特殊性称星 星活性。 （2） 2 Northern blotting Northern 杂交， （1） 即 DNA 与

7、RNA 的杂交，与 Northern 杂交的不同之处在于转移的是 RNA 而不是 DNA。 （1） Northern 杂交是转录水平的检测 ， 用于检测样品中是否有与探针同源的mRNA分子。（1） 3 Shuttle vector 穿梭载体， （1） 能够在两类不同的宿主中复制、选择和增殖的载体。 （2） 4 Chromosome Walking 染色体步查， （1） 采用一段分离自某一重组体一端的非重复 DNA 片段作为探针，以鉴定含有相邻序列的重 组克隆的方法称染色体步查。 （2） 5 Klenow fragment Klenow 片段， （1） 大肠杆菌 DNA 聚合酶经枯草杆菌蛋白酶水

8、解的大片段。 （1） 具有 53聚合和 35外切活性。 （1） 6 Universal primer 通用引物， （1） 参照载体上多克隆位点两侧的一段固定 DNA 序列设计的引物， （1） 用于分析插入片段的序列。 （1） 7 Competent cells 感受态细胞， （1） 能够吸收外源 DNA 的细胞称作感受态细胞。 （2） 三、分析简答题三、分析简答题（每小题 5 分，共 25 分） 1. 人类基因组的大小约为 3000Mb，测序方法有两种，即图谱测序法和全基因组鸟枪法。这 两种测序结果和分析于 2001 年分别发表在Nature和Science杂志上。在第一种方 法中，首先将靶基

9、因组部分酶切产生大分子 DNA 片段，经电泳分离纯化克隆到 BAC 载 体中。根据分子标记和指纹图谱构建 BAC 克隆重叠群，挑选单个克隆采取鸟枪法测序。 在每个 BAC 克隆内根据测序结果进行顺序拼接， 并与 BAC 克隆重叠群物理图谱对比， 完 成全部主体顺序的组装(The International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 2001, 409: 860921)。假如你是测序工 作组中的一员，由你负责某个 假如你是测序工

10、作组中的一员，由你负责某个 BAC 克隆子中约克隆子中约 100kb 的序列测定，该如何实施？的序列测定，该如何实施？ 分离纯化该质粒，构建外源 DNA 片段大小 2-5kb 的亚文库。 （1） 用构建亚文库的载体上的通用引物作大规模末端测序。 （1） 测序的各 reads 拼接，得到 contig。 （1） 借助 PCR 等手段，填补 contig 中的 gap。 （1） 通过酶切图谱验证测序结果。 （1） 2. 有多种载体用于克隆 PCR 产物，其中 A/T 载 体是常用的一种。A/T 载体也有多种工作方 式， 下图是 pCR2.1-TOPO 载体的核心工作原 理示意图。请说出 A/T 载

11、体克隆 PCR 产物的 一般原理， 以及 pCR2.1-TOPO 载体所拥有的 特殊工作方式。 用不具有 3-5外切活性的高 温 DNA polymerase（如 Taq）作 PCR 扩增时，其产物 3 多一个碱基 A。 （1） 在 A/T 载体的 3未端各有一个突出的碱基 T， 用于和 A 配对， 从而克隆 Taq polymerase 的 PCR 产物。 （2） Topoisomerase 第 274 位的酪氨酸与 DNA 5端磷酸之间形成的磷酸二酯键是不稳定的， 容易受到 DNA 3羟基的攻击。TOPO 载体利用其末端自身携带的 Topoisomerase 形成磷 脂键，不需要外加连接酶

12、。 （2） 3. 从苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种 YBT-1765 中克隆得到一个质粒 pBMB175， 选用限制性内 切酶 ClaI 和 XbaI 对该质粒进行酶切分析，得到以下如表所示的结果。请根据所得的酶切 片段大小，标出 ClaI 酶切位点在质粒 pBMB175 上的位置。 限制片段的大小（限制片段的大小（kb） 片段片段 序号序号 Cla Xba ClaI+XbaI 1 11.0 8.8 7.6 2 4.2 5.4 3.0 3 1.0 2.4 4 1.2 5 1.0 总计总计 15.2 15.2 15.2 3.0kb 和 14.0 kb ，答对一处给 2 分 15000 0 1000

13、2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 13000 14000 Xba Xba Xba pBMB175 (15.2kb) 5400 6400 4许多限制性内切酶切割 DNA 后可产生相同的突出末端，这些产物彼此之间可进行粘端连 接。 但在连接产物中相应位置的酶切位点就不存在了。 例如某 DNA 片段用 ClaI (AT/CGAT) 酶切后，可与 AccI (GT/CGAC)切割的载体连接，但在连接点处的 ClaI 和 AccI 位点都消失 了，相应的序列变成了 ATCGAC。下图最上面的序列为 ClaI/ AccI 连

14、接处的 DNA 序列。 通过这些步骤可在连接点处恢复 ClaI 位点，请指出每一步所用的关键酶和底物。 1.SphI 2.Klenow（或 T4 T7 polymerase ） 3.过量 dATP 4.S1 酶（或绿豆核酸酶） 5.ligase 每空一分 Recovering ClaI -ATCGA CAAGCTT- -TAGCTGGCC AA- -ATCGA TT- -TAGCT AA- -ATCGATT- -TAGCTAA- -ATCGACCGGCATGCAAGCTT- -TAGCTGGCCGTACGTTCGAA- -ATCGACCGGCATG CAAGCTT- -TAGCTGGCC GT

15、ACGTTCGAA- D ( 5 ) C ( 4 ) B ( 2 ， 3 ) A( 1 ) SphI 位点：GCATG/C 5. 用于cDNA克隆的方法很多,下图是 SMART 技术构建全长cDNA文库的基本原理流程图。 请叙述其核心步骤。 polyT 引物合成 cDNA 第一链，反转录酶具有末端转移酶活性，自动在产物末端加上 几个 d（C） 。 （2） 反转录过程中同时添加了带有 3 个 d（G）的引物，以该引物合成第一链的互补链，锚 定全长 cDNA。 （2） 引物延伸或长距离 PCR 得到双链 cDNA。 （1） 四、问答题四、问答题 （每小题 8 分，共 24 分） 1. 通过生物测定

16、，发现一种真菌具有抗某种细菌的抗菌活性。通过生物化学的方法从该真 菌中分离到一个具有抗细菌活性的蛋白质，该蛋白表现出良好的开发成蛋白药物的潜力。 若要在若要在 E.coli 或酵母菌中大量表达并制备该抗菌蛋白质，试问如何分离得到该蛋白的编 码基因。 或酵母菌中大量表达并制备该抗菌蛋白质，试问如何分离得到该蛋白的编 码基因。 测定该蛋白质的 N 未端氨基酸序列（1） 根据氨基酸序列设计简并引物，用作基因克隆的探针（2） 构建真菌的 cDNA 文库（2） 用探针作 Southern 杂交，从文库中筛选含该基因的重组子（2） 重组子的纯化、验证测序（1） 中如果是制备该蛋白的抗体 构建表达文库，从中

17、筛选则该题亦可给分。 2. 魔芋 (Amorphophallus) 是单子叶植物纲 (Monocotyledoeae)、泽泻目 (Alismatales)、天南 星科 (Areaceae) 的多年生草本块茎植物。在中国广泛种植的种是花魔芋。魔芋块茎的主 Poly A+RNA 经过修饰的经过修饰的oligo(dT)引物引物 合成第一链并通过合成第一链并通过RT加上加上(dC)尾巴尾巴 SMART II 或或 SMART IV 寡核苷酸寡核苷酸 转换模板并在反转录酶的作 用下延伸 转换模板并在反转录酶的作 用下延伸 引物延伸或通过引物延伸或通过LD-PCR 高质量的双链高质量的双链cDNA 要成分

18、是葡甘聚糖，可广泛应用于食品、医疗、化工、造纸、纺织和石油等行业，是一 种商业价值比较高的经济作物。目前魔芋产业发展面临的最大难题在于其种植上的软腐 病害，该病害可造成魔芋产量的严重损失，甚至绝收。然而，软腐病害目前尚无有效的 防治措施。魔芋软腐病是由胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜致病变种 (Erwinia carotovora pv. carotovora) 引起的，利用基因工程技术将抗欧文氏杆菌的基因转入魔芋，使魔芋具有 抗病特性，是解决魔芋病害的有效措施之一。现已将抗病基因现已将抗病基因高丝氨酸内酯酶基因高丝氨酸内酯酶基因 (aiiA)，转入魔芋并获得幼苗，经标记检测和斑点杂交检测，证实目标基因已经导入。下 一步将检测目标基因是否表达，请问可在哪几种水平上进行检测，如何实施。 ，转入魔芋并获得幼苗，经标记检测和斑点杂交检测，证实目标基因已经导入。下 一步将检测目标基因是否表达，请问可在哪几种水平上进行检测，如何实施。 转录水平检测： （4） 通过 Northern blotting 检测目标基因是否转录产生 mRNA。提取转基因魔芋植株的总 RNA，电泳、转膜。利用目标基因制备探针。探